Abstract
Background: The ever-growing awareness of environmental problems has led to the
implementing of ecological alternatives in industrial production. Cellulases
and hemicellulases are the most widely used enzymes in industry, guaranteeing the efficiency of production, with
a reduction in chemicals that pollute the environment. Aim. To select Bacillus
spp. strains that produce cellulases, β-mannanases, and xylanases for use
in animal feed. Materials and methods: Overall, ten strains were studied in
plates with minimum medium supplemented with Beech Xylan, locust vean gum,
and carboxymethylcellulose for the production of xylanases, β-mannanases,
and endo cellulases, respectively. The plates were incubated at 37 ºC for 24
hours and were coated with 0.5% Congo red solution. The diameter of the
hydrolysis area, and that of the colony, were determined to calculate the
potency index. Results: All the strains showed the capacity to produce the studied enzymes. As
a result, 23.3% of enzymatic activity was considered good. Bacillus subtilis
E-44 was the strain with the best enzymatic activity on the three evaluated substrates (3.01 ± 1.18; 3.82 ± 0.31, and 4.22 ± 0.23) for cellulases,
β-mannanases, and xylanases, respectively. Conclusions: Bacillus
subtilis E-44 was selected as the best cellulase and hemicellulase-producing strain, increasing
their possibilities in animal nutrition and the food industry.
Keywords: β-mannanases, bacterium, endocellulases, hemicellulase, xylanases (Source:
MeSH)
INTRODUCCIÓN
La concientización sobre los
problemas medioambientales ha conducido a la implementación de estrategias
ecológicas en la concepción de los procesos industriales (Angural et al.,
2020). Las tecnologías que conciben el uso de enzimas garantizan estos
preceptos, ya que permiten la utilización eficiente de las materias primas con
la generación mínima de residuos y la disminución en el uso de compuestos
químicos contaminantes (Danilova y Sharipova,
2020).
La demanda de las enzimas y su
aplicación en varias industrias crece continuamente. En el 2021 el mercado
mundial de las enzimas representó ganancias de 6,4 mil millones de dólares. Se
prevé que este valor aumentará a 8,7 mil millones para el 2026, con una tasa de
crecimiento anual compuesta del 3,6% (Benatti y
Polizeli, 2023). Las celulasas y las hemicelulasas (mananasas y
xilanasas) son las enzimas más empleadas a nivel industrial, específicamente,
el sector de la alimentación demanda notablemente su uso, donde representan más
del 30% del mercado (Cann et al., 2020).
Las celulasas, mananasas y xilanasas
son hidrolasas que degradan los enlaces glicosídicos presentes entre los carbohidratos
de conforman sus respectivos polímeros. Pertenecen a la familia glicosil
hidrolasas según el sitio de las enzimas activas en carbohidratos (Carbohydrate- Active Enzymes Database CAZy: http://www.cazy.org/) (Gonzalez-Gonzalez
y Miranda- Lopez, 2022).
También suelen ser reconocidas como enzimas fibrolíticas o carbohidrasas (Gusakov et al.,
2011; Mousa et al., 2022).
Las enzimas celulolíticas y
hemicelulolíticas se obtienen esencialmente a partir de microorganismos y una
de las principales fuentes utilizadas por las empresas biotecnológicas son las
cepas de Bacillus (Su et al.,
2020). Las bacterias de este género
son bacilos Gram positivos formadores de endosporas que no sintetizan
endotoxinas, razón por la cual muchas especies se consideran como seguras.
Estos microorganismos tienen un sistema de secreción enzimática eficiente, lo
cual les permiten degradar una variedad de sustratos, posibilitándoles la
supervivencia en diversos ambientes. Esto los convierte en excelentes
productores de enzimas de valor industrial. Es importante destacar además que
estas bacterias crecen rápido y los tiempos de fermentación, por lo tanto, se
hacen más cortos en comparación con otros microorganismos productores de
hidrolasas (Blibech et al., 2019). Aproximadamente, el 50% del total de enzimas
del mercado se producen a partir de Bacillus
(Sulistiyani et
al., 2021).
Sin embargo, la producción de estos
catalizadores, depende de las condiciones ambientales donde se desarrollen
estos microorganismos; por lo que es importante mencionar que todos los Bacillus no sintetizan siempre el mismo
tipo de enzimas. Para ello es necesario realizar una selección adecuada de los
microorganismos en función del sustrato. A partir de lo planteado anteriormente,
esta investigación se propone seleccionar cepas de Bacillus productoras de celulasas, β-mananasas y xilanasas para su
utilización en la alimentación animal.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo bacteriano
y preinóculo
El estudio se realizó con diez
cepas pertenecientes al género Bacillus,
las cuales se aislaron en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Matanzas. A partir de las muestras
conservadas a -30 °C en caldo nutriente y glicerol al 20%, se inocularon los
matraces que contenían 50 mL de caldo nutriente y se incubaron a 37 °C en
zaranda orbital a 110 rpm durante 16 h hasta que la densidad óptica a 600 nm
fue de 0,8 - 1.
Medio de cultivo
El ensayo
se realizó sobre placas Petri que contenían medio mínimo (MM) compuesto por
NaCl (0,1%), KH2PO4 (0,3%), K2HPO4
(0,6%), MgSO4 (0,12%), peptona (0,5%), extracto de levadura (0,3%),
agar (1,5%). Para evaluar cada enzima las placas se suplementaron con
carboximetilcelulosa (1%), goma de algarrobo (0,5 %) o xilano de haya (1%). El
pH del medio se ajustó a 7,5 con KOH (1 mol·L-1) y se esterilizó a
121°C durante 15 min. Los reactivos químicos se adquirieron de la firma
Sigma-Aldrich.
Determinación in vitro
de la producción enzimática de xilanasas, mananasas y celulasas
Las cepas
se inocularon con un asa de siembra estéril sobre la superficie del medio de
cultivo y las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C. El revelado de la
síntesis de las celulasas y hemicelulasas por las bacterias se realizó al
añadir la disolución de rojo congo al 0,5% a cada placa y se dejó a temperatura
ambiente durante cinco minutos; posteriormente se realizaron tres lavados con
NaCl 1 mol·L-1. El índice de potencia (IP) se calculó mediante la
relación existente entre el diámetro de la zona de hidrólisis y el diámetro de
la colonia medidos en milímetros. Según el IP los microorganismos evaluados se
clasificaron en excelente (IP > 5,0), bueno (2,0 > IP < 5,0) y pobre
(IP < 2,0) (Latorre et al., 2016). Se empleó un pie de rey Vernier (marca
Suertek cap. Sensibilidad de ± 0,02 mm) para realizar las mediciones de los
diámetros y se utilizó un diseño completamente aleatorizado con cuatro réplicas
para cada enzima.
Análisis estadístico
El
análisis de los datos se realizó con el software estadístico Statgraphics Plus
5.0. Se llevó a cabo el análisis de varianza
simple para determinar la presencia de diferencias estadísticamente
significativas entre las cepas con respecto a los sustratos evaluados. Para el
contraste de las medias se realizó la prueba de Student-Newman-Keuls. La significación se estableció para p < 0,05. Los datos
se muestran como la media ±
la desviación estándar.
RESULTADOS
Se estudiaron
diez cepas de Bacillus para evaluar
la capacidad de producir enzimas hidrolíticas de interés biotecnológico e
industrial. Los resultados mostraron que el 100% de las bacterias evaluadas mostraron
la capacidad de producir endocelulasas, β-mananasas y xilanasas. A partir
del análisis de los resultados, las cepas E-44 y C-31 se clasifican como buenas
productoras de las tres enzimas estudiadas. De igual forma, la cepa 45 BP se
considera buena productora de β-mananasas. El resto de las bacterias
estudiadas en la presente investigación mostró resultados inferiores en la
actividad enzimática relativa de las enzimas evaluadas, los cuales se
clasifican como pobres. La Tabla 1
muestra el perfil de la actividad enzimática de las cepas investigadas.
Tabla 1: Valores de los índices de potencia de las cepas de Bacillus sp. evaluadas para la
producción de xilanansas, β-mananasas y celulasas.
|
Cepas de Bacillus
|
Celulasas
|
β -Mananasas
|
Xilanasas
|
|
5 BP 1
|
1,31 ± 0,05de
|
1,48 ± 0,08de
|
1,44 ± 0,14de
|
|
23 BP4
|
1,74 ± 0,05c
|
1,51 ± 0,20de
|
1,63 ± 0,17cd
|
|
45 BP5
|
1,49 ± 0,06cd
|
2,03 ± 0,09c*
|
1,90 ± 0,07c
|
|
48 BP6
|
1,48 ± 0,09cd
|
1,66 ± 0,04de
|
1,68 ± 0,09cd
|
|
54 BP7
|
1,16 ± 0,11e
|
1,63 ± 0,10de
|
1,41 ± 0,11de
|
|
55 BP8
|
1,69 ± 0,21c
|
1,57 ± 0,16de
|
1,68 ± 0,12cd
|
|
E-44 9
|
3,01 ± 0,18ª*
|
3,82 ± 0,31ª*
|
4,22 ± 0,23ª*
|
|
C-31 10
|
2,41 ± 0,22b*
|
2,55 ± 0,25b*
|
2,55 ± 0,25b*
|
|
12 BCm11
|
1,13 ± 0,07e
|
1,34 ± 0,11e
|
1,60 ± 0,15cd
|
|
6 BCm12
|
1,12 ± 0,14e
|
1,76 ± 0,14d
|
1,22 ± 0,14e
|
Los datos
representan la media ± desviación estándar de cuatro réplicas. Letras
diferentes en una columna indican diferencias estadísticamente significativas según la
prueba de Student-Newmn-Keuls para p< 0,05. Las
cepas marcadas con (*) se consideran buenas productoras de la enzima.
El índice de potencia calculado de
las enzimas producidas por Bacillus
sp. E-44 es superior al de las otras cepas estudiadas. El análisis de varianzas
que comparó este factor, encontró diferencias estadísticamente significativas
para cada uno de ellos en función de las cepas estudiadas; de manera que
permite afirmar que esta cepa es la que mostró la mayor actividad de las tres
enzimas frente a los sustratos evaluados y por lo tanto se selecciona como la
mejor. En el revelado del ensayo para la determinación de la producción de
enzimas por Bacillus sp. E-44 (
Figura
1) se
pueden observar zonas claras alrededor del crecimiento del microorganismo en
las placas que contienen xilano, goma de algarrobo y CMC como sustrato, lo cual
indica que la bacteria expresó enzimas que despolimerizan el sustrato presente
en el medio de cultivo.
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DISCUSIÓN
La
bioprospección de microorganismos con capacidad para producir enzimas de
interés biotecnológico e industrial es un tema de actividad científica
constante. Para conseguir que esta búsqueda sea eficaz se requieren
metodologías de trabajo que sean rápidas, sensibles, replicables y económicas.
La técnica cualitativa más empleada es la propuesta por Teather y Wood (1982), la cual se basa en el crecimiento de
los microorganismos sobre un medio mínimo de sales que contiene el sustrato de
la enzima que se desea evaluar y la presencia de un colorante reportero de la
despolimerización (Moreno y Vélez, 2011).
En este
estudio se utilizaron el xilano de haya, la goma de algarrobo y la
carboximetilcelulosa como única fuente de carbono en el medio selectivo
empleado, el cual se combinó con el rojo congo. Este colorante interactúa con
los polímeros correspondientes en el medio, y al excretarse las enzimas se
producen disacáridos, monosacáridos y ácidos orgánicos como producto de la
degradación. La formación de un halo transparente alrededor de la colonia es
resultado de la disminución del pH (Li et al., 2020).
Como
previamente se mencionó, la capacidad que tienen varias especies de
microorganismos de degradar sustratos complejos se debe a la producción de
enzimas extracelulares y depende en gran medida de la fuente de carbono que se
emplea (Rodrigues et al., 2020). Las celulasas, xilanasas y β-mananasas
son enzimas inducibles en condiciones naturales por los productos de su propia
acción. Algunos autores plantean que las mismas se expresan constitutivamente a
bajos niveles, de manera que permiten la producción de fragmentos de bajo peso
molecular que actúan como sus propios inductores. La regulación de estas
enzimas está estrictamente controlada por los mecanismos de activación y de
represión catabólica; solamente se secretarán en presencia de su sustrato
específico y la disponibilidad de azúcares fácilmente asimilables reprimirá su
producción (Behera et al., 2017; Chauhan y Gupta, 2016).
El índice de
potencia (IP) es un indicador que se utiliza por varios autores para evaluar la
expresión de enzimas microbianas como celulasas (Li
et al., 2020), xilanasas (Latorre et al.,
2015) y mananasas (Riaz et al.,
2019). La actividad enzimática relativa es un indicador equivalente al índice
de potencia según Latorre et al. (2015). Estos autores utilizaron la misma escala para
la selección de cepas de Bacillus spp. que sintetizan celulasas y xilanasas.
Los resultados obtenidos permitieron su clasificación como excelentes y buenas
productoras de estas enzimas.
También, este
indicador se utilizó para seleccionar la cepa de Bacillus velezensis que excretó la mayor cantidad de celulasas en
un estudio realizado donde se evaluaron diez cepas (Li et al., 2020). Los
resultados estuvieron en correspondencia con los obtenidos en esta
investigación; incluso, estos fueron superiores. El índice de potencia para la
producción de celulasas de Bacillus
sp. E-44 fue superior al obtenido por Ma et al. (2020). De igual manera la
cepa seleccionada en la presente investigación mostró índices de potencia
superiores a Bacillus subtilis US 191
para la producción de mananasas, la cual mostró un índice de potencia de 1,60. (Blibech et al.,
2019). Sin embargo, los valores registrados en este estudios fueron
inferiores a los obtenidos por Zhang et al. (2018) para la producción
de xilanasas en la cepa de Bacillus
velezensis ZY-1-1. No obstante, estos datos concuerdan con los autores
anteriores en el sentido de que la actividad de las xilanasas fue superior a la
de las celulasas; lo que a decir de los mismos se debe a los mecanismos de
regulación de los genes que codifican las enzimas lignocelulósicas, los cuales
deben ser más investigados.
Las especies
del género Bacillus se caracterizan
por sintetizar enzimas extracelulares diversas, sin embargo, no siempre todas
tienen la capacidad de expresarlas con igual magnitud. Esto sugiere que esta es
una característica específica de la cepa en la que no influye la especie y
depende en gran medida del origen del microorganismo (Latorre et al., 2016).
Por otra parte, se informa en la literatura que la fase de crecimiento, la
temperatura y el pH afectan directamente la producción final de enzimas
extracelulares. Por tal motivo se optimizan diferentes condiciones de cultivo
para la secreción de estas biomoléculas, lo que confirma que la expresión de
estos catalizadores está estrictamente asociada con la adaptación al
crecimiento (Liu et al., 2023).
La bacteria
que mostró los mejores resultados en la síntesis de celulasas y hemicelulasas
está identificada como Bacillus subtilis
subespecie subtilis y se aisló a
partir de jugo de tomate en descomposición (Milián
et al., 2014). Esta cepa
resultó tener características potenciales para utilizarse como aditivo con
efecto probiótico en animales de interés zootécnico (Milián et al., 2017). Lo
resultados aquí obtenidos aumentan las posibilidades de utilizar a Bacillus subtilis E-44; esta vez en la
producción de enzimas que mejoren la calidad de los alimentos ricos en fibra,
lo cual incrementa el efecto probiótico de la misma (Luise et al., 2022). Las
celulasas, mananasas y xilanasas son hidrolasas que comúnmente se emplean en la
producción animal (Sathitkowitchai et al., 2022).
Además de los
posibles beneficios para la nutrición de animales de interés zootécnico de las
enzimas producidas a partir de esta cepa, su uso podría extenderse a la
obtención de las mismas para aplicarse en otros renglones de la alimentación
que demanden su empleo. Esto incrementaría las posibilidades de su uso
industrial, por ejemplo: para mejorar la calidad de los jugos de frutas y
vegetales, aumentar los rendimientos en el proceso de producción de café
instantáneo, suavizar la masa del pan e incrementar su volumen y reducir el
deterioro de los alimentos (Behera et al., 2017; Chauhan y Gupta, 2016;
Kaur et al., 2021; Marimuthu et al., 2019).
Por otra
parte, la hidrólisis completa de los carbohidratos complejos presentes en la
biomasa lignocelulósica, requiere de mezclas con múltiples actividades
enzimáticas. Con este propósito, el uso de cocteles enzimáticos es más
apropiado que las enzimas purificadas, ya que disminuye los costos y los procesos
son más eficientes. Desde el punto de vista de la alimentación animal, los
cocteles enzimáticos tienen efectos positivos en la mejora del valor
nutricional de los alimentos al afectar los porcentajes de fibra detergente
neutra (FDN) y fibra detergente ácida (FDA) e incrementar los de nutrientes
digestibles totales (Weschenfelder et al., 2023). Una de las
estrategias más acertadas para la producción de cocteles enzimáticos es el
empleo de microorganismos que posean la capacidad de secretar dos o más enzimas
celulolíticas y hemicelulolíticas (Angural et al., 2020). En este sentido,
sería conveniente evaluar las potencialidades de B. subtilis E-44 en la producción de cocteles enzimáticos frente a
sustratos lignocelulósicos complejos. Por otra parte, deben realizarse otros
estudios relacionados con la cuantificación de las actividades enzimáticas y la
determinación de la estabilidad de las enzimas a diferentes pH y temperaturas,
ya que los resultados que aquí se muestran constituyen un estudio preliminar y
el primer paso para seleccionar una cepa con potencialidades para producir
enzimas de interés biotecnológico e industrial.
CONCLUSIONES
La evaluación de la capacidad para producir celulasas y hemicelulasas
permitió seleccionar a dos cepas como buenas productoras. Sin embargo, Bacillus subtilis
E-44 mostró la mayor actividad en la secreción de celulasas, β-mananasas
y xilanasas. Esto incrementa las
potencialidades de su uso en la alimentación animal y las perspectivas de su
empleo en el sector de la alimentación.
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Contribución
de los autores
Concepción y diseño de
la investigación: YRF, MMMT, ALVA, YPH; análisis e interpretación de los datos:
YRF, MMMT, ALVA, YPH, ZRA; redacción del artículo: YRF, ALVA, MMMT y ZRA.
Conflicto
de intereses
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.
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, Madyu M. Matos Trujillo *