INTRODUCCIÓN
Meloidogyne spp. es el más dañino de
todos los géneros de fitonematodos que atacan al tomate en las regiones
tropicales y subtropicales y ocasiona pérdidas en el rendimiento estimadas de
hasta un 30 % (Netscher y Sikora, 1990). En Cuba
este nematodo, formador de nódulos (rkn), es además uno de los principales
problemas fitosanitarios observados en los cultivos protegidos (Gómez, Rodríguez, Enrique, Miranda y González, 2009). Los
compuestos químicos pueden controlar esta plaga más rápidamente y con mayor
efectividad (Whitehead, 1997). Sin
embargo, los daños causados al ecosistema, así como los efectos residuales han
traído consigo un aumento del interés para hallar sustitutos más seguros.
En ese sentido, se promueve la aplicación de métodos novedosos y más
selectivos para controlar Meloidogyne sp. La búsqueda de antagonistas
microbianos naturales puede ofrecer nuevas alternativas para el control
biológico de los nematodos. En Cuba varias especies microbianas, como Pochonia
chlamydosporia (Manzanilla-López
y Lopez-Llorca, 2017) y Tsukamurella
paurometabola (Mena et al., 2003), que se
utilizan en diferentes cultivos han mostrado una gran eficacia para controlar
este tipo de fitopatógeno bajo ciertas condiciones de manejo y tipos de suelo.
Otros aislados (Stenotrophomonas sp. CIGB G1 y Sphingobacterium sp.
CIGBTb) han demostrado alguna actividad contra zoonematodos en ensayos in
vitro (Sánchez et al., 2003) y han
mostrado potencial como biocontroles (Sánchez et al., 2018).
El género Sphingobacterium tiene una particularidad llamativa
debido a su versatilidad ante diferentes condiciones ambientales. Se ha aislado:
del suelo antártico, muestras clínicas, raíces de maíz, heces de ganado vacuno,
suelos boscosos y cultivables, lodo activado, nematodos y tejidos de hojas de Nicotiana
tabacum (Yabuuchi, Kaneko, Yano, Moss y Miyoshi, 1983; Shivaji et al., 1992; Holmes, Owen y Hollis, 1982; Kim,
Ten, Liu, Im y Lee, 2006; Mehnaz, Weselowski y Lazarovits,
2007; Zhang et al., 2012; Liu et al., 2012). Aunque
ha sido aislado de suelos con efectos represivos sobre los nematodos, existen
pocos reportes sobre su aplicación para controlar el patógeno en tomate.
En concordancia, el objetivo de este estudio fue caracterizar la bacteria
CIGBTb aislada de huevos de Tricostrongylus con relación a sus
propiedades biocontroladoras sobre los nematodos y sus posibles mecanismos de
acción en pruebas en macetas e in vitro, así como la detección de sus
propiedades patogénicas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Bacterias
CIGBTb se aisló de huevos de Tricostrongylus
spp. con una morfología alterada los cuales se desinfectaron con hibitane 0,5 %
y fueron colocados en medio agar soya triptona (TSA). El aislado se
crioconservó a -70 ºC en la colección del Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología de Camagüey, Cuba y su identificación se realizó con el sistema
API 20NE y análisis de la secuencia del gen ARNr 16S (números de acceso
GenBank: MG461604) obtenida por amplificación de PCR, mediante los cebadores universales
27 F y 1492R (Sánchez et al., 2018). El
análisis filogenético se realizó con el empleo del paquete informático MEGA,
versión 6,06, después de alineamientos múltiples de datos con CLUSTAL - X
(Thompson et al., 1997). Las distancias evolutivas de la cepa CIGBTb se
calcularon según el modelo de dos parámetros Kimura (Kimura, 1980), el
agrupamiento se basó en el método de máxima probabilidad (Felsenstein, 1981).
El análisis bootstrap (1 000 repeticiones) se empleó para evaluar la
tipología del árbol (Felsenstein, 1985).
La cepa para utilizar en los experimentos se creció en Caldo Soya
Triptona (TSB) (Oxoid; 30 g l−1) a 30 ºC, durante 24 h, a 250 rpm, en una
zaranda orbital.
El control positivo fue el
nematicida Hebernem®, obtenido a partir de la bacteria C924 (depositado el 8 de
agosto de 1995, según el Tratado de Budapest, en el Centraalbureau voor
Schimmelcultures, Baarn, Holanda, con el número de depósito CBS 613,95.
Los huevos del nematodo Haemonchus
sp. se colectaron de hembras adultas presentes en el abomaso de una oveja.
Los especímenes se lavaron con una
solución de cloruro de sodio (0,9 %) y se desinfectaron con hibitane al
0,5 % durante un minuto. Luego se incubaron en caldo nutriente (Oxoid), a
37 °C durante 24 horas. Las muestras se tamizaron (300, 60 y 30 µm de diámetro,
de manera consecutiva) y los huevos fueron retenidos en el tamiz de 30 µm.
Luego, los huevos se desinfectaron con hibitane (0,5 %) durante 5 minutos
e inmediatamente lavados dos veces en medio LB (8), diluido 1/10 con agua
estéril destilada (LBD). La manipulación se llevó a cabo bajo condiciones
asépticas. Los conteos de huevos y larvas se realizaron con un microscopio
óptico (Olympus).
Meloidogyne spp. se recolectó de plantas de
tomate en cultivos protegidos de la provincia de Ciego de Ávila, Cuba. La
población de Meloidogyne spp. se propagó en plantas de Solanum
lycopersicum, variedad UC-8 213, en el CIGB de Camagüey, Cuba. Las masas de
huevos se recolectaron de las raíces de S. lycopersicum. Los huevos
fueron separados de las masas con hipoclorito de sodio (0,5%), y se sumergieron
en agua destilada a 80C, hasta la realización del ensayo. Luego se
contaron a través de un microscopio binocular invertido (x40) Olympus CK 2. EL
conteo de huevos por masa se realizó de la misma manera, pero en cada
tratamiento se colocó una masa de huevos en tres pocillos de una placa de
poliestireno. Luego los huevos se separaron y finalmente se contaron.
Ensayos en macetas
Se llenaron bolsas de nailon (8 cm de diámetro x 15 cm de profundidad)
con 1 000 cm3 de sustrato (1:1 de arena
estéril: sustrato estéril enriquecido (Terraplant). El sustrato
se infestó con 1 500 huevos de Meloidogyne spp. colocados dentro de
las bolsas, a 3 cm de profundidad.
Después de cinco días, se añadió
50 mL de cultivo de Sphingobacterium CIGBTb (106 ufc/mL). El
control positivo que se utilizó fue el nematicida Hebernem®, mientras que se
utilizó el medio TSB como control negativo. Se empleó un diseño experimental
completamente aleatorio, con diez réplicas para cada tratamiento. Las plantas
de Solanum lycopersicum UC-8213 fueron trasplantadas a las
macetas a los siete días. A los 40 días se determinó el índice de agallamiento,
el número de nódulos por gramos de raíz, la altura de la planta, el peso de la
raíz y la planta y el número de huevos por masa (Bridge y Page, 1980)
Bioensayo de inhibición de la eclosión de huevos
A cada uno de los 24 pocillos de una placa Petri se le adicionó
aproximadamente de 90 a 100 huevos en 900 μL de agua y peptona, a
0,1 % (Meloidogyne spp.) en medio LB diluido 1/10 en agua (Haemonchus).
Luego se adicionaron 100 μL de bacterias en un medio de agua/TBS y se
probaron tres concentraciones de Sphingobacterium sp. CIGBTb (108,
107, 106 ufc/mL). El control positivo fue Hebernem® en la
misma concentración. El control negativo
recibió 100 μL de una solución de agua/TBS. Se cubrió la placa y luego se
incubó a 28 ºC. El efecto nematicida se determinó con un microscopio binocular,
por conteo de los J2s que no eclosionaron a las 72 h del tratamiento. Todos los
tratamientos tuvieron tres réplicas. El por ciento de inhibición se calculó
según la fórmula PIH = [(C − T)/C] x 100, donde C es el por ciento de
eclosión del control y T es el por ciento de eclosión del tratamiento.
Determinación de las enzimas extracelulares
El crecimiento en medio M9 suplementado con quitina coloidal (Shimahara y Takiguchi, 1988) indicó producción de quitinasa. Las
quitosanasas se determinaron por el crecimiento del organismo en las placas,
con Agar de Detección de Quitosanasa (ADQ) (Cheng y Li, 2000). Las proteasas se determinaron
mediante cultivos en las placas con Agar Nutriente y 0,5 % de gelatina,
seguido de detección con el reactivo de Frazier y la hidrólisis de caseína en medio agar nutriente con leche descremada
al 1 % (VanDemark & Lee, 1991). El sistema Apizym fue empleado para
la detección de fosfatasas, esterasas, lipasas, glucoronidasas, galactosidasa,
manosidasa, arilasas, glucosaminidasa-β-N-acetil, y fosfohidrolasa AS-BI
Naftol.
Los microorganismos se inocularon en tubos que contenían 8 mL
de caldo nutriente y se crecieron durante 12 h a 30 ºC. Se colocó una tirilla
embebida en acetato de plomo en la apertura del tubo (24). La reacción fue
positiva cuando la tira se tornó oscura.
Análisis
de datos
Se
confirmó la normalidad de los datos con la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Se
realizó un análisis de varianza (Rodríguez et al. (2005) a todos los datos ensayados para
determinar las diferencias significativas entre los tratamientos. Se compararon
las medias según la prueba de Duncan (P <0,05). Se empleó el software
Statgraphics Plus, 5.0, para Windows.
RESULTADOS
CIGBTb mostró colonias amarillas, convexas y circulares después de dos
días de incubación. Las células fueron Gram-negativas a la tinción, en forma de
bacilos cortos, inmóviles y no formadores de esporas. El sistema API 20 NE
identificó la cepa CIGBTb como Sphingobacterium spiritivorum. El
análisis filogenético con las secuencias 16S de ARNr confirmó que este
pertenece al género Sphingobacterium. El árbol filogenético de máxima
probabilidad mostró que CIGBTb formó un grupo coherente con los miembros del
género Sphingobacterium, así como una rama intragénero con Sphingobacterium
spriritivorum NCTC 11386 (Fig. 1). Sin embargo, la cepa exhibió un valor de
secuencia génica menor de 97 % (95,58 %), por lo tanto, no pertenece
a esta especie.
2020.%20Huevos%20zoonematodo_archivos/image005.png)
Fig. 1. Árbol filogenético según el método de máxima probabilidad
basado en la secuencia de ARNr 16S. El árbol muestra la relación entre la cepa
CIGBTb y algunos miembros representativos de la
familia Sphingobacteriaceae. Los valores bootstrap (expresados en por cientos de
1 000 repeticiones) por encima de 70 % aparecen en los nódulos de las
ramas. La barra representa 2 sustituciones por cada 100 nucleótidos.
El tratamiento in vitro con el empleo de Sphingobacterium
sp. CIGBTb, a concentraciones de 108 ufc/mL provocó una inhibición
de 87 % en la eclosión de los huevos de Meloidogyne sp. y
100 % de inhibición en la eclosión de los huevos de Haemonchus sp.
(Fig. 2). Se observó una gran vacuolización y poca movilidad en las larvas
que lograron emerger.
A2020.%20Huevos%20zoonematodo_archivos/image007.jpg)
B2020.%20Huevos%20zoonematodo_archivos/image009.jpg)
Fig 2. Inhibición en la eclosión
de huevos de Meloidogyne spp (A) y Haemonchus spp (B) a
diferentes concentraciones de Sphingobacterium CIGBTb
En las macetas, Sphingobacterium sp. CIGBTb redujo
significativamente (P < 0,05) el índice de formación de agallas,
de 5,3 a 2,9. No se observaron diferencias significativas en el control
positivo. Por otra parte, Sphingobacterium sp. CIGBTb disminuyó
significativamente las formaciones de agallas (58 %) en las raíces de Solanum
lycopersicum (Tabla 1).
Tabla 1. Efecto de Sphingobacterium sp. CIGBTb en las raíces
de S. lycopersicum UC-8213 infestado con Meloidogyne spp.
|
Tratamiento
|
Severidad de los nódulos
|
|
Índice de formación de nódulos
|
Nódulos/g de raíz
|
|
CIGBTb
|
2,9 ± 1,5 b
|
27,8 ± 4,8 b
|
|
Control
|
5,3± 1,2 a
|
47,8 ± 2,8 b
|
Letras
diferentes representan diferencias significativas en la prueba de Duncan (P
< 0, 05).
Una evaluación del número de huevos por masa, aislados de los diminutos
nódulos que se formaron, mostró que Sphingobacterium
sp. CIGBTb redujo el número de huevos en cada masa (53 %), mientras que no
se observaron cambios en los controles (Fig. 3).
2020.%20Huevos%20zoonematodo_archivos/image011.jpg)
Fig 3. Número de huevos por masa en las plantas tratadas con
caldo de soya triptona (control) Sphingobacterium sp. CIGBTb (CIGBTb) y
Hebernem® (C924)
Letras diferentes representan diferencias
significativas en la prueba de Duncan (P < 0, 05).
Una concentración de aproximadamente 105 ufc/mL, Sphingobacterium
sp. CIGBTb también estimuló el crecimiento de Solanum lycopersicum.
También aumentó el peso de la planta en 0,59 veces por encima del peso de las
plantas del tratamiento control sin la bacteria (Fig. 4).
2020.%20Huevos%20zoonematodo_archivos/image013.jpg)
Fig 4. Peso de plantas de S.
lycopersicum UC-8213 infestadas con Meloidogyne spp.,
40 días después del tratamiento con caldo soya triptona (control), Sphingobacterium
sp. CIGBTb (CIGBTb) y Hebernem® (C924)
Letras diferentes representan diferencias
significativas en la prueba de Duncan (P < 0, 05).
El CIGBTb presentó varios posibles atributos de patogenicidad, como
tripsina, esterasas y enzimas lipasa estereasas. El sulfuro de hidrógeno y las
proteasas extracelulares (con la gelatina y la caseína como sustratos) no
fueron detectados mediante la prueba convencional y la cepa logró crecer
lentamente en medio de cultivo mínimo con quitina y quitosano, aunque no se
observó la formación de halo de hidrólisis. Además, los resultados ofrecidos
por el sistema Apizym fueron positivos para la fosfatasa ácida y la fosfatasa
alcalina, dos enzimas importantes para la solubilización de fósforo en el suelo
por medio de las bacterias.
DISCUSIÓN
Anteriormente se había reportado
el género Sphingobacterium como un componente de la rizosfera de vid con
propiedades supresoras de nematodos (Vargas-Ayala,
Rodrı́guez-Kábana, Morgan-Jones, McInroy, & Kloepper, 2000; Aballay, Mårtensson, &
Persson, 2011). Estos últimos demostraron
la efectividad de la cepa de Sphingobacterium spiritivorum 64 in
vitro, así como otra cepa del género (Sphingobacterium nematocida)
que se aisló en China durante un estudio sobre la diversidad de los organismos
nematicidas endofíticos (Liu et al., 2012). No
obstante, existe poca información sobre los ensayos en maceta y los posibles
mecanismos de acción de estos géneros de bacterias. Mena et al. (1996) patentó la cepa de Sphingobacterium
spiritivorum C926 y demostró su efectividad para controlar Radopholus
similis y Meloidogyne incognita en ensayos de campo y en macetas.
Sin embargo, Sphingobacterium CIGBRTb no solo tiene actividad
nematicida, sino que también estimula el crecimiento de plantas de tomate,
posiblemente debido a la solubilización de los fosfatos del suelo, mediante la
producción de fosfatasas ácidas y alcalinas, aunque otros mecanismos no han
sido estudiados. Anteriormente se conocía la actividad estimuladora del
crecimiento de las plantas por parte de Sphingobacterium canadense (Mehnaz et al., 2007) y Sphingobacterium
pakistanense (Ahmed et al., 2014).
Existen varios mecanismos que
utilizan las bacterias durante interacciones antagonistas con los nematodos.
Uno de ellos es el papel que desempeñan las enzimas hidrolíticas, lo cual está
bien documentado para una serie de organismos con actividad híperparásita (Chernin & Chet, 2002). En el
caso de Sphingobacterium CIGBTb, la cepa tenía actividad quitinasa,
quitosanasa, tripsina, esterasa y lipasa esterasa. Estos atributos patogénicos pudieran traer
consigo cambios enzimáticos en las capas de quitina, las proteínas y otros
lípidos que conforman la cubierta de los huevos y otras estructuras de Meloidogyne
sp., y por consiguiente, facilitan la ocurrencia de parasitismo.
Existen varias cepas de Sphingobacterium
que producen quitosanasas similares a Mitsuaria ChoA (Yun, Amakata, Matsuo, Matsuda,
& Kawamukai, 2005) y
esta cepa en particular pudiera ser parte de ellas. Además, CIGBTb libera
esterasas C4 y C8, como el Sphingobacterium nematocida (Liu et al., 2012),
que pudieran explicar la inhibición de la eclosión in vitro de huevos de
Meloidogyne sp. Sin embargo, las larvas que logran emerger y parasitar
las plantas de tomate en los ensayos de maceta no solo producen un bajo número
de agallas, sino también que estas son más pequeñas, con menos huevos en las
masas que el control. El
silenciamiento de un gen de parasitismo, el 16D10, expresado en las células de
las glándulas subventrales de M. incognita también provoca un efecto
similar en Arabidopsis. Se produce una reducción sustancial del número
de agallas entre 63 y 90 %, así como en el tamaño de las agallas (Huang, Allen, Davis, Baum y Hussey, 2006).
CONCLUSIONES
Los zoonematodos son una fuente apropiada para la búsqueda de
biocontroladores de nematodos fitopatógenos. Sphingobacterium sp.
CIGBTb aislado de huevos de Tricostrongylus sp. es una alternativa
novedosa para el control biológico. La cepa reduce el número de huevos por
masa, a diferencia del ingrediente activo de C924 del producto nematicida
Hebernem®, que libera quitinasas y sulfuro de hidrógeno. Los resultados de este
estudio corroboraron la efectividad del aislado nativo como antagonista, así
como su potencial como biofertilizante de las plantas y control biológico del
nematodo Meloidogyne sp., formador de nódulos en Solanum
lycopersicum.
REFERENCIAS
Aballay, E., Mårtensson, A., &
Persson, P. (2011). Screening of rhizosphere bacteria from grapevine for their suppressive
effect on Xiphinema index Thorne & Allen on in vitro grape
plants. Plant and Soil, 347(1-2), 313-325. https://link.springer.com/article/10.1007/s11104-011-0851-6
Ahmed, I., Ehsan, M., Sin, Y.,
Paek, J., Khalid, N., Hayat, R., & Chang, Y. H. (2014). Sphingobacterium
pakistanensis sp. nov., a novel plant growth promoting rhizobacteria
isolated from rhizosphere of Vigna mungo. Antonie van Leeuwenhoek, 105(2), 325-333. https://link.springer.com/article/10.1007/s10482-013-0077-0
Bridge, J., & Page, S.
(1980). Estimation of root-knot nematode infestation levels on roots using a
rating chart. International Journal of Pest Management, 26(3), 296-298. https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09670878009414416
Cheng, C. Y., & Li, Y. K.
(2000). An Aspergillus chitosanase with potential for large‐scale preparation of chitosan oligosaccharides. Biotechnology and
Applied Biochemistry, 32(3), 197-203. https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1042/BA20000063
Chernin, L., & Chet, I. (2002). Microbial
enzymes in the biocontrol of plant pathogens and pests. In Enzymes in the
Environment. USA: CRC Press.
Felsenstein, J. (1981). Evolutionary trees from
DNA sequences: a maximum likelihood approach. J. Mol. Evol.,
17(6), 368-376. https://link.springer.com/article/10.1007/BF01734359
Felsenstein J. (1985). Confidence limits on
phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution, 39(4):783-91. https://doi.org/10.1111/j.1558-5646.1985.tb00420.x
Gómez, L., Rodríguez, M., Enrique, R., Miranda, I. &
González, E. (2009). Factores limitantes de los rendimientos y calidad de las
cosechas en la producción protegida de hortalizas en Cuba. Revista de Protección Vegetal,
24(2),
117-122. http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1010-27522009000200007
Holmes, B., Owen, R., &
Hollis, D. (1982). Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated
from human clinical specimens. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 32(2), 157-165. https://doi.org/10.1099/00207713-32-2-157
Huang, G., Allen, R., Davis,
E. L., Baum, T. J., & Hussey, R. S. (2006). Engineering broad root-knot
resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential
root-knot nematode parasitism gene. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 103(39), 14302-14306. https://www.pnas.org/content/103/39/14302.short
Kim, K.-H., Ten, L. N., Liu,
Q.-M., Im, W.-T., & Lee, S.-T. (2006). Sphingobacterium daejeonense
sp. nov., isolated from a compost sample. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56(9),
2031-2036. https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/ijs.0.64406-0
Kimura M. (1980). A simple method for estimating
evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of
nucleotide sequences. Journal of molecular
Evolution, 16(2):111-120. https://link.springer.com/article/10.1007/BF01731581
Liu, J., Yang, L.-L., Xu,
C.-K., Xi, J.-Q., Yang, F.-X., Zhou, F.,... Li, W.-J. (2012). Sphingobacterium
nematocida sp. nov., a nematicidal endophytic bacterium isolated from
tobacco. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,
62(8), 1809-1813. https://doi.org/10.1099/ijs.0.033670-0
Manzanilla-López, R. H., & Lopez-Llorca,
L. V. (Eds.). (2017). Perspectives in Sustainable Nematode Management
Through Pochonia chlamydosporia Applications for Root and Rhizosphere. Health. Springer. https://link.springer.com/book/10.1007%2F978-3-319-59224-4
Mehnaz, S., Weselowski, B.,
& Lazarovits, G. (2007). Sphingobacterium
canadense sp. nov., an isolate from corn roots. Systematic and applied
microbiology, 30(7), 519-524. https://doi.org/10.1016/j.syapm.2007.06.002
Mena, J., De la Riva, G.,
Vázquez, R. P., Fernández, M., Coego, A., García, M., ... & Mencho, J. D.
(1996). Nematocidic agent and method for the biocontrol of nematodes. World Intellectual Property
International Bureau.
Mena,
J., Pimentel, E., Veloz, L., Hernández, A., León, L., Ramírez, Y.,... Pujol, M.
(2003). Aislamiento y determinación de cepas bacterianas con actividad
nematicida. Mecanismo de acción de C. paurometabolum C-924 sobre
nematodos. Biotecnología Aplicada, 20(4), 248-252. http://elfosscientiae.cigb.edu.cu/PDFs/Biotecnol%20Apl/2003/20/4/BA002004-248252RP.pdf
Netscher, C., & Sikora, R. A. (1990).
Nematode parasites of vegetables. Plant parasitic nematodes in subtropical and
tropical agriculture., 237-283. https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19901182756
Rodríguez, M. G., Sánchez, L., Gómez, L., Hidalgo, L.,
González, E., Gómez, M., ... & Hernández, R. (2005). Meloidogyne spp., plagas de las hortalizas:
alternativas para su manejo en sistemas de cultivo protegido. (No.
2132). Revista
de Protección Vegetal. http://www.sidalc.net/cgibin/wxis.exe/?IsisScript=pubs.xis&method=post&formato=2&cantidad=1&expresion=mfn=002045
Sánchez, I., Alvarez, I.,
Wong, I., Somontes, D., Basulto, R., Morán, R. ... Mena, J. (2018). Characterization of
Cuban native bacteria isolated from nematodes as potential biological control
agents for Meloidogyne spp., 33(1), 1-11. http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1010-27522018000100004
Sánchez, I., Mena, J., Coca,
Y., Marín, M., Hernández, A., Olazábal A, Zamora, J. (2003). Acción in vitro de
cepas bacterianas sobre Haemonchus spp.Informe Preliminar. Rev. Salud Anim. l., 25(3), 145-148.
Shimahara, K., &
Takiguchi, Y. (1988). Preparation of crustacean chitin. Methods Enzymo, 161,
417-423. https://doi.org/10.1016/0076-6879(88)61049-4
Shivaji, S., Ray, M., Rao, N.
S., Saisree, L., Jagannadham, M., Kumar, G. S., ... Bhargava, P. M. (1992). Sphingobacterium
antarcticus sp. nov., a psychrotrophic bacterium from the soils of
Schirmacher Oasis, Antarctica. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 42(1), 102-106. https://doi.org/10.1099/00207713-42-1-102
Thompson, J. D., Gibson T. J., Plewniak, F.,
Jeanmougin, F. & Higgins, D. G. (1997). The CLUSTAL_X windows interface:
flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis
tools. Nucleic Acids Research,
25(24):4876-82. https://doi.org/10.1093/nar/25.24.4876
VanDemark, P. J., & Lee, J. J. (1991).
Selected exercises from microbes in action: a laboratory manual of
microbiology. WH Freeman.
Vargas-Ayala, R.,
Rodrı́guez-Kábana, R., Morgan-Jones, G., McInroy, J. A. &
Kloepper, J. W. (2000). Shifts in soil microflora induced by velvetbean (Mucuna deeringiana) in cropping systems to control root-knot
nematodes. Biological Control, 17(1), 11-22. https://pdfs.semanticscholar.org/8919/8d6b6db7ab2f617ce8a5fb2a60a932db63be.pdf
Whitehead, A. G. (1997). Plant-parasitic nematodes: their importance and control. Plant Nematode Control, 1-12. https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19981700197
Yabuuchi, E., Kaneko, T.,
Yano, I., Moss, C. W., & Miyoshi, N. (1983). Sphingobacterium gen.
nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium
multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium
indologenes sp. nov.: Glucose-Nonfermenting Gram-Negative Rods in CDC
Groups IIK-2 and IIb. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 33(3), 580-598. https://doi.org/10.1099/00207713-33-3-580
Yun, C., Amakata, D., Matsuo,
Y., Matsuda, H., & Kawamukai, M. (2005). New chitosan-degrading strains
that produce chitosanases similar to ChoA of Mitsuaria chitosanitabida. Applied
and Environmental Microbiology, 71(9), 5138-5144. DOI: 10.1128/AEM.71.9.5138-5144.2005
Zhang, J., Zheng, J.-W., Cho,
B. C., Hwang, C. Y., Fang, C., He, J., & Li, S.-P. (2012). Sphingobacterium
wenxiniae sp. nov., a cypermethrin-degrading species from activated sludge.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62(3),
683-687. https://doi.org/10.1099/ijs.0.033118-0
Contribución de
los autores
ISO:
Diseño y supervisión de aislamiento e identificación de las cepas, diseño de
experimentos in vitro e in vivo y redacción del manuscrito. RMV:
Diseño, formulación y supervisión del experimento, redacción y revisión del
manuscrito. IAL: Recolección de los datos experimentales y redacción del
manuscrito. IWP: Recolección de los datos experimentales y redacción del
manuscrito. DSS: Recolección de los datos experimentales in vitro y
redacción del manuscrito. EPV: Diseño y supervisión del experimentos y
redacción del manuscrito. JMC: Análisis estadístico de los datos y redacción
del manuscrito, MRB, análisis estadístico de los datos y redacción del
manuscrito.
Conflicto de
intereses
Los autores declaran que no existen conflicto de intereses.
2020.%20Huevos%20zoonematodo_archivos/image002.jpg){kind=small}
, Rolando Morán Valdivia*2020.%20Huevos%20zoonematodo_archivos/image003.jpg){kind=small}
, Irene Alvarez Lugo*