Abstract
Background: The utilization of
edible biomass of Dichrostachys cinerea is an option for ruminant nutrition and the
control of parasitosis in these animals. Aim.
To evaluate in vitro anthelmintic activity of aqueous extracts from
re-shoots and leaves of adult leguminous plants.
Methods: Three mother solutions were made from the plant
material collected. Then the aqueous extracts were prepared by means of
infusion, decoction, and crushing. They were 10% diluted for infusion and
decoction, and 10, 15, and 20% for crushing, resulting in 15 treatments. A
total of four (two positive and two negative) controls were included. Soil worm
was used as a biological model. A Petri dish was used in every treatment, and
filled with 10 ml of the extract and six worms each. Time was measured (min)
for occurrence of paralysis, and death of worms.
Results: The anthelmintic
effect of infusion and 10% decoction showed no significant differences in the
times of death of worms. The preparation of extracts by crushing contributed to
a larger extraction of secondary metabolites, which are responsible for the
anthelmintic activity demonstrated in this study.
Conclusions: All the extracts showed in vitro anthelmintic
activity. The aqueous extract collected by crushing, and 20% dilution was the
most effective of the three plant materials studied.
Key words: helminths, leaves, legumes, sicklebush, re-shoots (Source: AIMS)
INTRODUCCIÓN
Los parasitosis causadas por nemátodos
gastrointestinales en rumiantes representan un serio problema a nivel mundial
ya que afectan la productividad de los animales infestados, debido a que tienen
un impacto negativo sobre la tasa de crecimiento, la condición corporal y la
fertilidad; aumentan la susceptibilidad a enfermedades de diferentes orígenes e
incrementan la mortalidad ocasionando pérdidas económicas muy importantes en la
producción pecuaria (Felice, 2015; Angel, Arrieta y Fernández, 2015). Se trata de una enfermedad multietiológica ocasionada por la acción conjunta de varios
géneros y especies de parásitos, por lo que se consideran un complejo
parasitario que afecta por igual a todos los organismos (Dorta-Contreras,
2007).
Durante las últimas cuatro
décadas se han desarrollado moléculas sintéticas antiparasitarias de gran
eficacia, amplio espectro y bajo efecto residual (Dorta-Contreras,
2007). Sin
embargo, en la actualidad el tratamiento de esta enfermedad se ha complicado
debido a la resistencia a fármacos comerciales por lo que es necesario utilizar
alternativas para el control de estos patógenos resistentes o multirresistentes, una de las cuales puede ser el uso de
metabolitos secundarios de plantas con actividad antibacteriana y/o sobre
nematodos gastrointestinales (Hernández-Alvarado et al., 2018; Medina et al.,
2014; Epe y Kaminsky, 2013;
Satyajit y Lutfun, 2012). En esta dirección existen numerosas investigaciones que
han abordado el estudio del potencial nutracéutico de
diversas plantas, entre ellas D. cinerea, cuyo uso aún no se ha extendido en Cuba.
Particularmente se señala su efectividad en el control de nemátodos
gastrointestinales (Arece, Roche, López y Molina, 2012) por lo que resulta
válido asumir que el uso de la biomasa comestible de esta planta podría ser una
alternativa eficaz para el control de parasitosis en pequeños rumiantes.
Por
tanto, el objetivo de la presente investigación es evaluar la actividad
antihelmíntica “in vitro” de
extractos acuosos obtenidos por diferentes métodos a partir de las legumbres, hojas
de plantas adultas y rebrotes de D. cinerea, previamente secadas y molinadas.
MATERIALES Y MÉTODOS
La
investigación se realizó en el laboratorio de microbiología de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la
Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. El material
vegetal se obtuvo de las legumbres, rebrotes tiernos y hojas de plantas adultas
de D. cinerea establecidas en áreas
pertenecientes a la
Cooperativa de Créditos y Servicios “El Vaquerito”, ubicadas
en la carretera a Camajuaní km 2.5, Santa Clara,
provincia de Villa Clara, Cuba. El período de recolección abarcó los meses de
abril y mayo de 2017.
Obtención y preparación del material
vegetal
La
biomasa colectada fue sometida a deshidratación en estufa a
temperatura de 45 °C
durante cinco días. Además, a las legumbres se le dio un golpe de
estufa a 60 °C
durante treinta minutos.
Posteriormente se molió en un micromolino de
cuchillas a 3000 rpm, el material vegetal molinado
fue pasado por un tamiz interno de 3 mm y se almacenó en frascos herméticos
hasta la realización del ensayo.
Preparación
de los extractos acuosos
Se
ejecutó el siguiente procedimiento secuencial:
1.
Por cada material vegetal se obtuvo
una solución madre, para lo cual se tomaron 40 g de legumbres y 10 g de hojas de plantas
adultas y de rebrotes tiernos, respectivamente, se le añadió agua destilada a
temperatura de ebullición (100 oC) hasta
completar 100 mL.
2.
Después de someter la solución madre a 30 minutos de reposo,
se obtuvieron los extractos acuosos mediante infusión, decocción (10 minutos) y
maceración.
3.
Cada extracto fue filtrado con papel de filtro de porosidad media, se le
midió el pH con pHmetro METROMâ modelo 520 y se corrigió a
pH neutro con una sustancia búfer a base de bicarbonato de sodio.
4.
Por último, los extractos fueron diluidos a diferentes
concentraciones (infusión y decocción al 10 % y maceración al 10, 15 y 20 %),
para un total de 15 tratamientos (cinco en cada tipo de material vegetal).
Éstos fueron contrastados con cuatro tratamientos controles consistentes en dos
antiparasitarios comerciales de efectos conocidos – control positivo - (Piperazina 1 % y Levamisol 10 %)-
de comprobada actividad antihelmíntica y dos controles negativos (solución
nutricia de Prosser y Zimmerman,
y agua destilada).
Protocolo
experimental
Se utilizó como modelo
biológico la lombriz de tierra (Lumbricus terrestris Linnaeus, 1758), cuyos
individuos fueron extraídos cuidadosamente del medio de
cultivo donde se mantuvieron a temperatura entre 25 y 27 ºC,
humedad relativa de 80 %, pH neutro y alimentación rica en materia orgánica.
Posteriormente fueron transferidos a un recipiente con agua destilada para su
lavado y selección según tamaño asegurando así una longitud uniforme con
diferencias inferiores a ±3,0 mm. Para cada
tratamiento, incluidos los controles, se empleó una placa de Petri de 9,5 cm de
diámetro, en las que se añadieron 10 mL del extracto
en cuestión y seis lombrices (réplicas).
Todas las placas de Petri se
colocaron en el laboratorio de parasitología manteniéndose a temperatura
estable entre 25 y 27 oC.
La actividad antihelmíntica se
determinó según el procedimiento reportado por Ejiofor, Zaman y Das (2017), se
registró el tiempo, en minutos, requerido para la parálisis y muerte de las
lombrices. Como criterio de parálisis se utilizó la detención de los movimientos
respecto a su motilidad normal, mientras que la muerte se determinó cinco
minutos después de detectada la parálisis. Para ello se colocaron las lombrices
en tubos de ensayos de 25 mm
de diámetro con 10 mL de agua destilada a temperatura
de 45oC durante 10 segundos, para estimular e inducir movimientos en
ellas, si aún se encuentran vivas. Durante el ensayo se mantuvo estricta
observación de los cambios en la motilidad y alteraciones en el tegumento de
las lombrices, tanto de forma visual como con auxilio del estereoscopio.
Análisis estadístico
Los datos primarios fueron
tabulados en Microsoft Office Excel 2010, para su posterior procesamiento
mediante el paquete estadístico Statgraphics Centurion versión XVI.I (Statistical
Graphic Corp. USA, 2006). Previa comprobación de la
normalidad de los datos (prueba de Kolmogorov-Smirnov)
y de la homogeneidad de las varianzas (prueba de Cochran),
se ejecutó un análisis de variancia multifactorial (ANOVA multifactorial) sin
interacción para comparar los efectos de los métodos de extracción, el tipo de
material vegetal y la concentración de los extractos obtenidos, tanto para los
tiempos de parálisis como de muerte. Los efectos de las partes de la planta en
los extractos obtenidos mediante infusión y decocción se compararon mediante la
prueba de t-Student.
Declaración de datos
El presente estudio forma parte del protocolo de investigación doctoral de
la autora principal, por lo que el fichero de datos primarios y las salidas de
las técnicas estadísticas empleadas sólo se enviarán mediante petición escrita
de los editores de la revista.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Actividad antihelmíntica de
las soluciones control
En
las lombrices colocadas en la solución de Piperazina
al 1 % se aprecia una parálisis flácida al cabo de los 13 minutos de
aplicación. La muerte del 100 % ocurrió como promedio a los 41 minutos. Esto
coincidió con lo reportado por Flores (1996), quien señala que la Piperazina
actúa sobre la unión mioneural o placa motriz de las
lombrices produciendo parálisis flácida. Sin embargo, no concuerdan con los
obtenidos por Hukkeri, Kalyani, Harpali
y Manui (1993), en un estudio similar con
lombrices de la especie Pheritima postuma ya
que encontraron que la parálisis y la muerte se produjeron a los 40 y 60
minutos, respectivamente. Esta diferencia puede ser atribuida al modelo
experimental utilizado en cada ensayo.
Al
colocar las lombrices en el control positivo de Levamisol
al 10 %, se produjo la muerte a los dos minutos de iniciado el experimento, con
una parálisis espástica. En todos los casos, la parálisis de las lombrices va
precedida de una ligera excitación caracterizada por contracciones, movimientos
en forma de látigo, estiramientos y encogimientos para tratar de escapar del
medio. Todo esto conduce finalmente a la muerte de la lombriz. Flores (1996)
reportó un comportamiento similar cuando empleó fármacos convencionales en
terapia contra la helmintiasis.
En los controles negativos (solución nutricia de Prosser y Zimmerman, y agua
destilada) las lombrices conservaron su motilidad por un período superior a las
48 horas, y no se apreciaron alteraciones del tegumento. Las lombrices se
encontraban agrupadas y respondieron a estímulos físicos. Por todo lo
anteriormente señalado se descartan las muertes por causa de otros factores que
no fuese la acción de las sustancias evaluadas.
Actividad antihelmíntica de los extractos acuosos al 10 % obtenido por
infusión y decocción, respectivamente
Las
Tablas 1 y 2 muestran que, al comparar el efecto antihelmíntico de la infusión
y decocción al 10 %, no se apreciaron diferencias significativas para la muerte,
aunque si ocurre la muerte. Este comportamiento demuestra que ambos métodos de
extracción, independientemente del tipo de material vegetal, extraen en
magnitud similar los principios activos responsables de la actividad vermífuga.
Estos principios activos constituyen los metabolitos secundarios responsables
de la actividad antiparasitaria tal como ha sido reportado por Arece,
Roche, López y Molina (2012) al suministrar extractos
acuosos de D. cinerea
a ovejas. Al respecto se destacan los triterpenos por su
potencial nematicida (Rodés,
Peña y Hermosilla, 2015) y los taninos ya que pueden unirse a enzimas y alterar
el metabolismo microbiano, afecta las funciones vitales, la movilidad, la
nutrición y posiblemente, la reproducción (Medina et al., 2014).
Varios autores sostienen que el
consumo de plantas ricas en metabolitos secundarios y especialmente aquellas
que contienen taninos y otros compuestos fenólicos, constituye una alternativa
para el control de nemátodos gastrointestinales en
ovinos y caprinos (Hernández et al., 2014)
y en equinos (Chicaiza-Tisalema et al., 2016). En este sentido Aguilera-Valle, Delgado-Martínez y
Salas-Romero (2015) sugieren que D. cinerea puede ser efectivo en tratamientos
antihelmínticos sobre poblaciones de ciatostomas
resistentes a Albendazol, aunque son necesarios
estudios in vivo para confirmar sus
propiedades antihelmínticas y evaluar su uso en el manejo sostenible de esta
parasitosis.
Tabla 1.
Tiempos medios (min) de parálisis de las lombrices para los extractos obtenidos
por infusión y decocción.
|
Método de obtención
del extracto
|
Partes de D. cinerea
|
EE ±
|
|
Rebrotes
|
Hojas de planta adulta
|
Legumbres
|
|
Infusión al 10 %
|
178,33bM
|
132,00cM
|
366,67aN
|
9,07
|
|
Decocción al 10 %
|
118,67bN
|
103,17bM
|
394,00aM
|
4,92
|
|
EE ±
|
12,27
|
17,78
|
8,66
|
|
|
Soluciones
control
|
|
Piperazina 1%
|
13
|
|
Levamisol 10%
|
0
|
a, b, c superíndices desiguales por fila difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
M, N superíndices desiguales por columna difieren para P < 0,05 (prueba
de Tukey)
Tabla 2
Tiempos medios (min) de muerte de las lombrices para los extractos obtenidos
por infusión y decocción.
|
Método de obtención
del extracto
|
Partes de D. cinerea
|
EE ±
|
|
Rebrotes
|
Hojas de planta adulta
|
Legumbres
|
|
Infusión al 10 %
|
462,50aL
|
309,17aL
|
390,83aM
|
26,52
|
|
Decocción al 10 %
|
360,17bM
|
395,17abL
|
457,00aL
|
28,71
|
|
EE ±
|
61,29
|
69,12
|
17,93
|
|
|
Soluciones control
|
|
Piperazina 1%
|
41
|
|
Levamisol 10%
|
2
|
a, b, c superíndices desiguales por fila difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
L, M superíndices desiguales por columna difieren para P < 0,05 (prueba
de Tukey)
A pesar de lo
planteado anteriormente, los tratamientos presentaron menor efectividad que la Piperazina
al 1 %.
Actividad antihelmíntica de los extractos
acuosos al 10, 15 y 20 % obtenidos por maceración
Las
Tablas 3 y 4 muestran los resultados correspondientes a los extractos al 10,
15 y 20 % obtenidos por maceración, cuya actividad biológica es dependiente de
la concentración, las más efectivas fueron al 20 y 15 %, en ese orden.
Tabla 3.
Tiempos medios (min) de parálisis de las lombrices para los extractos obtenidos
por maceración al 10, 15 y 20 %.
|
Método de obtención
del extracto
|
Partes de D. cinerea
|
EE ±
|
|
Rebrotes
|
Hojas de planta adulta
|
Legumbres
|
|
Maceración al 10
%
|
1996,41aL
|
536,67bL
|
185,82cL
|
81,79
|
|
Maceración al 15
%
|
1180,83aM
|
56,67cM
|
196,67bL
|
26,35
|
|
Maceración al 20
%
|
131,17bN
|
30,67cM
|
148,33aM
|
3,60
|
|
EE ±
|
27,84
|
81,26
|
4,33
|
|
|
Soluciones Control
|
|
Piperazina 1%
|
13
|
|
Levamisol 10%
|
0
|
a, b, c superíndices desiguales por fila difieren para P <
0,05 (prueba de Tukey)
M, N superíndices desiguales por columna difieren para P
< 0,05 (prueba de Tukey)
Tabla 4.
Tiempos medios (min) de muerte de las lombrices para los extractos obtenidos
por maceración al 10, 15 y 20 %.
|
Método de obtención
del extracto
|
Partes de D. cinerea
|
EE ±
|
|
Rebrotes
|
Hojas de planta adulta
|
Legumbres
|
|
Maceración al 10
%
|
2660,83aL
|
1050,73bL
|
221,67cM
|
81,36
|
|
Maceración al 15
%
|
1924,00aM
|
192,67bM
|
240,00bL
|
60,88
|
|
Maceración al 20
%
|
389,17aN
|
110,33cM
|
185,00bN
|
15,21
|
|
EE ±
|
98,33
|
29,66
|
2,95
|
|
|
Soluciones control
|
|
Piperazina 1%
|
41
|
|
Levamisol 10%
|
2
|
a, b, c superíndices desiguales por fila difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
L, M, N superíndices desiguales por columna difieren para P < 0,05 (prueba
de Tukey)
La
obtención de los extractos por este método (maceración) propició una mayor
extracción de metabolitos secundarios, los cuales son responsables de la
actividad antihelmíntica demostrada en el presente estudio.
El efecto antihelmíntico de
los extractos contrastados en condiciones “in
vitro” ha quedado demostrado en el presente estudio, cuyo modo de acción se
debe probablemente a la presencia de compuestos fenólicos, principalmente
taninos (Chicaiza-Tisalema et al., 2016; Ferreira et al., 2015), los cuales tienen capacidad para
formar complejos con las proteínas de los parásitos (Alonso-Díaz,
Torres-Acosta, Sandoval-Castro y Hoste,
2010), afectándose así la biología y supervivencia de los nemátodos.
La existencia de otros metabolitos secundarios (alcaloides, terpenoides),
unido al alto contenido de proteínas y carbohidratos en las hojas (Martín-Casas
et al., 2017; Heuzé, Tran y Giger-Reverdin,
2016; Vijayalakshmi, Periyanayagam,
Kavitha, Akilandeshwar,
2013) le confieren a D. cinerea un potencial nutracéutico
de inestimable valor para alimentación y salud de los animales que la consumen
(Marius et al.,
2018), a la vez que su empleo productivo constituye una alternativa
agroecológica para el control de esta planta exótica invasora (Reinoso-Pérez, Joseau y Valdez, 2019) y para reducir la metanogénesis ruminal (Vélez-Terranova,
Campos-Gaona, Sánchez-Guerrero, 2014), mejora la eficiencia de fermentación y
reduce las emisiones atmosféricas de este gas de efecto invernadero.
Los estudios conducidos
por Araújo-Alves
et al. (2017) concluyeron que las fracciones proteicas
contenidas en las hojas, tallos y raíces de Spigelia anthelmia
también intervienen en el control de nemátodos
gastrointestinales, por lo que puede inferirse que ello es válido para la
biomasa comestible de D. cinerea, en adición,
las fracciones no comestibles, como la corteza y la raíz, contienen una amplia
diversidad de metabolitos secundarios (Rodés, Peña y
Hermosilla, 2015), muchos de ellos responsables de los efectos antiparasitarios
atribuidos a esta planta.
CONCLUSIONES
Todos extractos obtenidos a partir de
las legumbres, rebrotes y hojas de plantas adultas de D. cinerea mostraron actividad
antihelmíntica “in vitro”.
La efectividad “in vitro” de los extractos obtenidos por maceración sobre la
supervivencia de las lombrices es dependiente de la concentración, los más
efectivos fueron al 20 y 15 %, en ese orden.
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Contribución
de los autores
Concepción
y diseño de la investigación: AYBE, MRP, RER, EAO; análisis e interpretación de
los datos y redacción del artículo: AYBE, MRP.
Conflicto
de intereses
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.
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, Mario Reinoso Pérez **