INTRODUCCIÓN
La paramfistomosis es una enfermedad
parasitaria emergente con áreas endémicas en las regiones tropicales y
subtropicales, presente en Asia, Europa, África, América y Australia (Hayider, Mekuria y Mekibib, 2018). Las
prevalencias de esta parasitosis en ganado bovino varían entre el 1,2 % en
ciertas regiones de Argelia, 32,17 % en la India, 39,10 % en América y el 55.9
% al Noroeste de España (Siben, Domatsky,
Nikonov y Beletskaya, 2018).
Es producida por diferentes
especies de trematodos (Digenea),
pertenecientes a la superfamilia Paramphistomoidea,
donde están incluidas las
principales especies que poseen interés en medicina veterinaria. Entre ellas
encontramos a Paramphistomum cervi; P. microbothrioides, Calicophoron daubneyi,
Calicophoron calicophoron y Cotylophoron
cotyloforum. Tienen un ciclo biológico
indirecto en el que participan como hospederos intermediarios los moluscos de
agua dulce (Tandon, Roy, Shylla y Ghatani, 2014;
Sargison, Shahzad, Mazeri y Chaudhry, 2019). De ellos, Galba cubensis se comportó como un eficiente hospedero
intermediario en el continente americano,
específicamente en Cuba (Vázquez, Sánchez, Alba, Rodríguez y Pino, 2013; Abreu,
Piña, Diéguez, Vázquez y Fimia, 2019).
La paramfistomosis tiene dos
formas clínicas, una aguda intestinal causada por las formas inmaduras y la
otra crónica ruminal ocasionada por los parásitos
adultos. Cuando las formas larvales se adhieren a la mucosa, atrofian las
vellosidades intestinales, producen gastroenteritis, deshidratación y pérdida
grave de la condición corporal, pues se reduce la ingesta voluntaria de alimentos
y/o reducciones en la eficiencia de absorción de los nutrientes (Sanguankiat et al., 2016; Ploeger et al., 2017).
Los
anfistómidos adultos también llevan a cabo una acción
expoliadora del fluido ruminal, en especial sobre
lípidos y ácidos grasos. Por todo ello, se puede afirmar que la parampfistomosis produce un descenso de
la producción de ácidos grasos volátiles (AGV), de proteínas microbianas en el
rumen y proteínas by-pass. Como consecuencia hay disminución de
la conversión alimenticia y reducción de la producción de leche (Casas, 2018; Forbes, 2018).
En Cuba existen condiciones climáticas
favorables de precipitación, humedad relativa y temperatura (Palacio, Bertot,
Molento, Vázquez, Izquierdo y Arenal, 2017). Esto
permite el desarrollo y la sobrevivencia de los estadios larvales en el pasto y
del hospedero intermediario. El objetivo de esta investigación es determinar la
presencia de la paramfistomosis en bovinos de sacrificio en Camagüey.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la investigación se utilizaron los datos
de la inspección visual post-mortem de 550 bovinos sacrificados en el período
marzo-mayo del 2017, en los mataderos pertenecientes a la industria alimentaria
de Camagüey.
Los animales muestreados procedieron de 6 de
los 13 municipios con que cuenta la provincia Camagüey, distribuidos de la
siguiente forma: 105 de Camagüey, 92 de Jimaguayú, 60 de Minas, 135 de Najasa, 49 de Sibanicú y 109 de Vertientes.
Examen de la necropsia
helmintológica
Durante el examen post-mortem, se
inspeccionaron de forma sistemática el rumen y el retículo con el fin de
detectar la presencia o ausencia de Paramphistomum sp. y la intensidad
de infestación. Cada día de trabajo se inspeccionaron todos los animales
sacrificados. En el proceso de faenado se extrajeron los pre-estómagos ligados
en sus extremos con el fin de evitar pérdida de parásitos y su contenido. La
disección del Rumen coincidió con los bordes o curvaturas dorsal y ventral y la
del retículo con las curvaturas mayor y menor. Todo ello con el fin de exponer
los paramfistómidos.
Se
calculó la prevalencia por municipios. Para la
intensidad de infestación de los paramfistómidos se
establecieron cuatro niveles: Nulo (cero presencias), bajo (de 1 a 500), medio
(de 501 a 1000) y alto (más de 1000).
Extracción de ADN
Se tomaron 10 parásitos por cada rumen de
animales procedentes del municipio Vertientes. Se colocaron en alcohol al 70 %.
El ADN se extrajo mediante un tratamiento con
100 μg / ml de proteinasa
K (Boeringer Manheim,
Alemania) en tampón de lisis (Tris-HCl 10 Mm, pH 8,0,
EDTA 100 mM, SDS al 0,5 %) por 5 a 8 h a 60 ºC bajo agitación suave. Las muestras se trataron tres
veces con fenol y una vez con cloroformo. Luego, la fase acuosa se trató con 20
μg/ml de RNaseA
(Sigma, EE. UU) durante 1 h a 37ºC. El ADN se purificó por extracción sucesiva
con fenol: cloroformo y cloroformo, y se precipitó con dos volúmenes de etanol
en acetato de sodio 0,3 M a -20ºC durante 2 h. Después de la centrifugación, el
sedimento de ADN se secó y se resuspendió en 200 μl
de agua doblemente destilada.
Reacción en cadena de la polimerasa
El gen del ARN ribosómico 18S (ARNr)
se amplificó mediante cebadores universales 27F adelante
(5´-CCAGAATTCAGAGTTTGATCMTGGCTCA-3´) y 1492 contrario, reverso
(5´-ACCAAGCTTTACGGYTACCTTGTTAGGACTT-3´) en un termociclador
(Eppendorf, Hamburg, Germany) bajo las siguientes condiciones: desnaturalización
inicial (95°C durante 5 min), seguido de 34 ciclos cada uno a 94°C por 1 min,
58°C por 1 min y 72°C por 3 min, seguido de un paso de extensión final a 72°C
por 7 min. Los productos del PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa (1
%, w/v). Los amplicones se eluyeron
y los productos de ADN purificado se secuenciaron en Myleus
(MG, Brasil). Las secuencias de nucleótidos se analizaron mediante el programa
de herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST). En la determinación final de Paramphistomum sp se utilizó
software MEGA 6 para el análisis de ADN probabilístico por el método Neighbo-Joining, con un Bootstrap
de 1000 réplicas. Cada especie que se incluyó en el análisis contiene su número
de referencia en GenBank.
Análisis estadístico
Se contabilizaron las variables municipios y
órgano infestados (rumen, retículo y rumen+retículo)
e intensidad de infestación.
Se
empleó el software STATGRAPHICS Centurión XV ver 20.2.06 del 2007 para realizar
una tabla de contingencia entre las variables intensidad de infestación y los municipios. Se compararon las
proporciones de la prevalencia de los municipios con respecto a la media. Se
realizó una comparación de la proporción media de la intensidad de infestación
según los órganos infestados. Se aplicó
en todos los casos la prueba de independencia Chi-cuadrado para P<0,05.
RESULTADOS
De un total de 550 animales
analizados, la prevalencia arrojó un valor del 68,54 %.
El nivel de intensidad de
infestación predominante en todos los municipios fue el bajo con un 46,18%
(Figura 1). De ellos, Vertientes y Camagüey con el 9,82 % y 9,45 % de los casos
respectivamente alcanzaron los mayores valores, mientras que Sibanicú, con solo
el 4,73 % de los casos, fue el de menor intensidad de infestación en este
nivel.
2020.%20Determinación%20de%20la%20paramfistomosis_archivos/image004.png)
Figura 1. Resultado de la Tabla de Contingencia para
la Intensidad de infestación según los municipios.
Nota: los valores representados corresponden a la frecuencia observada
de cada municipio según la intensidad de infestación.
El análisis de
comparación de proporciones evidenció diferencias significativas de la media
del municipio Najasa con respecto al resto de los
municipios (Figura 2). La proporción
que se obtuvo en el resto de los municipios en estudio se encuentra entre los
límites establecidos, según su frecuencia observada.
2020.%20Determinación%20de%20la%20paramfistomosis_archivos/image006.jpg)
Figura 2. Comparación de
proporciones de la prevalencia de los municipios con respecto a la media.
LSD: Límite Decisión Superior LC:
Línea Central LDI: Límite Decisión Inferior.
Al realizar un análisis de
proporciones con un 95 % de confianza entre la intensidad de infestación según
los órganos infestados se comprobó que el nivel rumen+retículo
es el que presenta diferencias significativas con respecto al rumen y retículo
(Figura 3).
2020.%20Determinación%20de%20la%20paramfistomosis_archivos/image008.png)
Figura 3. Comparación de la
proporción media de la intensidad de infestación según los órganos infestados.
LSD: Límite Decisión Superior LC: Límite
Central LDI: Límite Decisión Inferior.
Se
secuenciaron 348 bases nitrogenedas de la región intergénica ribosomal del 18S.
Los individuos encontrados en la provincia Camagüey tienen una
identidad del 99,7 % con Cotylophoron cotylophorum.
El mejor alineamiento de la secuencia según
BLAST se muestra en la Figura 4. El único
cambio que se observó es una transición de timina por citosina. No aparece
ningún espacio en el alineamiento de la secuencia (E 3e-175). Otras especies
mostraron identidades entre 93 y 99%, con menos cobertura
de la secuencia.
2020.%20Determinación%20de%20la%20paramfistomosis_archivos/image010.png)
Figura 4. Mejor alineamiento de la secuencia según BLAST.
El
análisis filogenético indicó que la especie encontrada en estos muestreos tiene
un 85 % de probabilidad de pertenecer al clade
donde se encuentra Cotylophoron cotylophorum
(Figura 5). Sin embargo, Bacillus licheniformis no
tiene ninguna probabilidad de pertenecer a este grupo, lo que confirma que el
análisis es correcto.
2020.%20Determinación%20de%20la%20paramfistomosis_archivos/image012.jpg)
Figura 5. Análisis filogenético de acuerdo al método Neighbo-Joining (Bootstrap de
1000 réplicas). Secuencias de referencia que se muestran por especie (10) y sus
respectivos números de acceso GenBank. Cotylophoron cotylophorum JX678257.1, Calicophoron shillongensis, JX678251.1, Orthocoelium orthocoelium JX678255.1, Fischoederius elongatus KU530203.1, Fischoederius cobboldi KU530202.1, Orthocoelium orthocoelium JX678255.1, Olveria bosi JX678253.1, Gastrothylax crumenifer JQ688412.1, Carmyerius dollfusi KP639636.1, Explanatum explanatum KY068130.1. La
secuencia KT924442.1 de Bacillus licheniformis se usó como un
grupo externo.
DISCUSIÓN
Al analizar la prevalencia
obtenida, se comprobó que obtuvimos valores similares (68,54 %) a los de Cauquil et al.
(2016) en el Archipiélago Melanesio francés de Nueva Caledonia, quienes
determinaron una prevalencia del 70 % de paramfistomosis en vacas adultas. Los
autores refirieron que estos niveles podrían
ser porque esta parasitosis no se considera un problema clínico o de producción
en Nueva Caledonia y el tratamiento dirigido a este parásito es improbable, lo
que se corresponde con la situación actual de Cuba. Este elevado nivel de
prevalencia también está influenciado por las características del ecosistema en
la provincia de Camagüey. El mismo está constituido por terrenos bajos llanos,
típicos de sabanas inundables en períodos lluviosos, lo que resulta en una
mayor dispersión del hospedero intermediario.
La prevalencia en Italia que
reportaron Sanna et al. (2016) fue de un 55,9 % en vacas adultas, resultado
que se puede considerar elevado pues más del 50 % de los animales están
afectados con la paramfistomosis, lo que podría ser consecuencia de la
presencia de reservorios de agua, lagos, ríos y disponibilidad de hospederos
intermedios adecuados en estos lugares. Así mismo ocurre en Etiopía, donde se
determinaron prevalencias de 51,82 % (Ayalew,
Tilahun, Aylate, Teshale y Getachew, 2016). Esto ocurre probablemente
porque existen factores ambientales favorables similares a las de nuestro país
para el desarrollo de los moluscos de agua dulce.
Cuando los animales inspeccionados
presentan infestación en rumen+retículo, es mayor que
cuando la infestación ocurre en un solo órgano, ya sea rumen o retículo. Esto
demuestra que no existe especificidad tópica de las duelas por rumen o
retículo, a pesar que, desde el punto de vista anatómico, el retículo no
presenta las mismas condiciones que el rumen para su establecimiento.
En Galicia, España, se registró una
proporción de 94,3 % en el rumen y solo un 5,7 % en el retículo (González-Warleta
et al., 2013). Los autores infirieron que la menor carga en este
último órgano puede estar relacionada con la escasez de papilas y por la
acumulación de CO2 y metano presente. Además, la forma de las
papilas en el atrio ruminal pueden tener un efecto
protector sobre los tremátodos y la presencia de una
capa fluida puede favorecer la ingesta de nutrientes por parte del parásito.
Los resultados
moleculares obtenidos confirman los de Kotrla
y Prokopic (1973) quienes
determinaron, según su morfología, que en Cuba circulaba el Cotylophoron cotylophorum. Asimismo, evidenciaron
que, en Camagüey, entre las especies encontradas era la que más abundaba. Sin
embargo, durante esta investigación no se encontró ninguna de las otras
especies detectadas por estos autores, lo que implicaría un estudio molecular
específico para estas variedades.
La
confirmación de la presencia de esta especie está en concordancia con uno de
los géneros (Cotylophoron)
determinados por Alarcón y Velásquez (2009)
en regiones
tropicales y subtropicales de mayor impacto en la producción ganadera de América.
Estos investigadores demostraron que C. cotylophorum es una de las especies que circulan en
Colombia. Así mismo, Morales, Pino y Moreno
(2015) informaron su presencia en Venezuela en los estados Aragua, Zulia
y Bolívar. En el sureste de Irán, ésta fue
la segunda especie con mayor prevalencia (20%) detectada en mataderos de bovinos
(Khedri et
al., 2015).
CONCLUSIONES
Se detecta paramfistomosis en los bovinos de
sacrificio en tres mataderos de Camagüey, con diferencias entre los municipios.
Se demuestra baja intensidad de infestación en
los animales de abasto, sin encontrar especificidad por un órgano en
particular.
La especie de Paramphystomum que circula en los bovinos de sacrificio
pertenece al clade donde se encuentra Cotylophoron cotylophorum.
La
alta prevalencia de esta especie evidencia que la paramfistomosis constituye
una enfermedad desatendida en las poblaciones bovinas cubanas.
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Contribución
de los autores
Concepción
y diseño de la investigación: YLC, AAC, YTE, RVM, ECS, NAB; análisis e
interpretación de los datos: YLC, AAC, YTE, RVM; redacción del artículo: YLC,
YTE.
Conflicto
de intereses
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.
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, Amilcar
Arenal Cruz *