Abstract
Aim. This study looked
to assess the effect of different oral doses of progesterone (P4) on estrus
synchronization and ovulation of covies. Methods: The study was
conducted in the high Ecuadoran tropical areas, on a commercial farm located at
2 500 meters above sea level. A total of 35 multiparous Peruvian female covies
and five male covies were used in the experiment. The procedure consisted of
five treatments: T1= 0.33mg/kg (n=7). T2=0.28mg/kg (n=7). T3=0.22mg/kg (n=7).
T4=0.17mg/kg (n=7). T5=0.11mg/kg (n=7). The vaginal membrane aperture was
evaluated on the last day (15d) of P4 administration every 24 hours (h). A
vaginal cytology test was performed to establish the moment of ovulation, which
helped determine the moment of estrus and ovulation. A simple ANOVA was
performed to analyze the vaginal membrane aperture, the vaginal cytology,
estrus, and ovulation. A 5% Tukey test was conducted for multiple comparisons. Results:
The T1, T4, and T5 covies showed 100% vaginal membrane aperture, whereas T2 and
T3 underwent 85.7% vaginal aperture, with a general mean of 94.3%. More than
50% vaginal cells from T1 were superficial at 37.7 ± 4.84 hours following P4
withdrawal; T2 and T3 needed 14.3 additional hours. Ovulation in T1 was
observed at 85.7 ± 4.84 hours, with a value similar to T2 (88.0 ± 5.05 hours),
and no differences between them (p>0.05). The T3 and T4 animals ovulated
20.6 hours after. However, the T5 animals needed more hours for ovulation
(113.1 ± 4.42). Conclusion: The oral administration of 0.33 mg of
progesterone for 15 days in a row helped synchronize estrus at 48 hours
following the administration of progesterone.
Keywords: Female covy, synchronization, estrus, ovulation, progesterone (Source:
AGROVOC).
INTRODUCCIÓN
El cobayo es considerado un
excelente modelo animal para estudios de laboratorio (Trejo et al., 2019), por tener un proceso de
implantación placentaria interticial y formación de sincitiotrofoblasto similar
al del humano (Wang et al., 2019). Sin embargo, uno de los
principales desafíos asociados con el uso de cobayos para investigaciones
relacionadas con la reproducción, es la determinación exacta del día de
apareamiento y la ovulación.
La duración del ciclo estral es de
16 días aproximadamente (Araníbar y
Echevarría, 2014), y consta
de cuatro fases: proestro con un promedio de duración de 1-1,5 días, estro 8-24
horas, metaestro 1-1,5 días y diestro 13-15 días (Kuhne y
Mendoza, 1992). Durante
las fases del ciclo estral existe la interacción de los estrógenos y la
progesterona, la primera presenta niveles altos en el estro y declina con la
ovulación, mientras que la progesterona domina el período diestro (Wilson et al., 2021). Además, se ha descrito la
existencia de dos ondas foliculares durante el ciclo estral de la cobaya, la
primera culmina entre los días 10-11 y la segunda termina en la ovulación (Bland,
1980).
Se ha valorado la administración de
progesterona oral durante 15 días
consecutivos, por ser un método de fácil aplicación, llegando a obtener
animales en celo hasta en un 90% (Grégoire et al., 2012). Sin embargo, en otras
especies se ha demostrado que dosis bajas de progesterona oral, provocan el
desarrollo de quistes foliculares (De Rensis
y Kirkwood, 2016).
En consecuencia, el objetivo del trabajo fue valorar el efecto de diferentes dosis de
progesterona oral en la
sincronización del celo y la ovulación en cobayas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales y granja
Se utilizaron 35 cobayas de línea
peruana, con edades entre 4 a 6 meses, multíparas, sanas, con peso de 1000 a 1200 g y una condición corporal
(CC) de 2,5 a 3,5 en escala de 1 (caquéctico) a 5 (obeso); según Ara et al. (2012). Además, se emplearon cinco
cobayos fértiles, con edades de 6 a 8 meses y pesos
entre 1500 y 2000 g.
La experimentación se llevó a cabo
en una granja comercial ubicada en el trópico alto (2500msnm), temperatura
promedio de 11,8 oC. Los animales tuvieron una etapa de adaptación
de 15 días previo al inicio del estudio. La alimentación se basó en un 20% de
Ray grass (Lolium multiforum), 70%
Alfalfa (Medicago sativa) y 10%
balanceado comercial con un 16,27% de proteína, suministrado dos veces al día.
Los cobayos recibieron 12 horas luz y 12 horas obscuridad.
Diseño experimental
Se evaluaron cinco dosis diferentes de progesterona
oral (Altrenogest, Regumate®, MSD Animal Health, Francia) en la sincronización de celo y ovulación:
T1=0,33mg/kg (n=7). T2=0,28mg/kg (n=7). T3=0,22mg/kg (n=7). T4=0,17mg/kg (n=7).
T5=0,11mg/kg (n=7). Las dosis fueron administradas por vía oral, con la ayuda de una
pipeta automática (Boeco, Alemania) regulable (20 μl a 200 μl), durante 15 días consecutivos (Fig. 1). A partir del último día de administración de la hormona (día
15), se evaluó la presencia de celo y
ovulación cada 24 horas (h).
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Figura 1. Protocolo del experimento: día
0=inicio del protocolo, aplicación de progesterona oral (Altrenogest) hasta el
día 15. MV=valoración diaria de la apertura de la membrana vaginal.
CV=citología vaginal. ME= determinación de monta efectiva.
Valoración del celo
La
apertura de la membrana vaginal fue monitoreada durante cinco días (6:00 am) consecutivos, a partir del día 15 del protocolo (Fig.
1), en base a lo descrito por Li et al. (2015), con ciertas modificaciones.
El animal
fue colocado en decúbito dorsal, se desinfectó la
vulva y se observó la presencia o ausencia de la membrana vaginal; se establecieron cuatro categorías
en base al porcentaje de apertura: cerrada (0%), inicio de apertura (25%); semi
abierta (50%) y abierta (100%). Se consideró la cobaya en celo cuando
presentó un 50% de apertura de membrana vaginal.
Las
muestras de mucosa vaginal (citologías) se obtuvieron cada 24 horas a partir
del día que se verificó el inicio de la apertura de la membrana vaginal (25%)
hasta el cierre de la misma. Se utilizó un hisopo descartable estéril de
6", el cual se humedeció y se introdujo hasta el tercio medio de la
vagina, una vez allí se realizó un raspado en el sentido de las manecillas del
reloj. Las muestras se extendieron en láminas portaobjetos y se colorearon con
tinción Diff-Quick (Tinción rápida, BIOMED, Ecuador); según
especificaciones técnicas del fabricante. El frotis fue observado al microscopio
óptico a 400x. En base a los resultados se estableció que la cobaya estaba en
celo cuando presento un 50% o más de células superficiales con forma poliédrica
y núcleo picnótico o células superficiales anucleares (Arcila et al., 2019).
El día
que la cobaya presentó el 50% de apertura de la membrana vaginal se incorporó
un macho durante una hora (8:00 am). Para determinar la receptibilidad de la
hembra se evaluó la monta efectiva mediante la identificación de
espermatozoides en las citologías vaginales que se realizaron cada 24 horas, al
día en el que se observó espermatozoides en la muestra se le resto 24 horas
para establecer el día y la hora de la monta realizada.
Valoración de la ovulación
El
momento de la ovulación se fijó por citología vaginal según lo descrito por Grégoire et al. (2012), quienes
describieron que el momento de la ovulación se relaciona con la presencia de
mayor cantidad de leucocitos y escasa cantidad de células intermedias.
Análisis
estadísticos
Los datos fueron analizados con el
paquete GraphPad Prism versión 8.0, (2016, GraphPad Software,
EE.UU). Se obtuvieron los estadígrafos principales de
las variables estudiadas. La normalidad de los datos se estableció con la
prueba de Shapiro Wilk, donde siempre p>0,05. Para el análisis de la apertura de la
membrana vaginal, citología vaginal, estro y ovulación se aplicó un ANOVA
simple y la prueba de Tukey al 5% para las comparaciones múltiples.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Apertura de la membrana vaginal (MV)
El día 15 del protocolo la membrana vaginal (MV) presentó un color rosado
pálido (Fig. 2; panel 1) y se mostró totalmente cerrada (Fig. 3; panel 1). A
medida que se acercó el celo (día 16) se detectaron cambios progresivos en la coloración de la MV
que se tornó rosado obscuro (Fig. 2; panel 2).
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Figura 2. Cambios de
coloración de la membrana vaginal luego del retiro de la progesterona. Panel 1:
MV=membrana vaginal de color rodado pálido, en la parte inferior la entrada al
ano. Panel 2: membrana vaginal de color rosado oscuro, en la parte inferior la
entrada al ano.
A día 18 se observó en promedio la apertura de la membrana vaginal en un
50% (Fig. 3; panel 2), llegando a observarse totalmente abierta en los días 19
y 20 del protocolo en forma general (Fig. 3; panel 3).
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Figura 3: Apertura de la membrana vaginal.
Panel 1: MV=membrana vaginal cerrada 0%. Panel 2: membrana vaginal semi abierta
en 50%. Panel 3: membrana vaginal abierta 100%.
Al analizar cada uno de los tratamientos se observó que el total de las
cobayas de T1, T4 y T5, presentaron apertura de la membrana vaginal (100%),
mientras que en T2 y T3 el 85,7% de hembras exhibió apertura de la misma; obteniendo una media general del 94,3%. Estos
resultados nos demuestran que la administración diaria de progesterona oral
(Altrenogest), en dosis que van desde los 0,11 a 0,33 mg/kg de peso corporal,
provocaron sincronización del celo en porcentajes similares a los descritos por
Grégoire et
al. (2012), quienes consiguieron un 93 % de apertura al
utilizar progesterona oral (Altrenogest) en dosis de 0,22mg/kg. Por lo tanto, se puede reducir a la mitad la
dosis hasta hoy recomendada provocando el mismo porcentaje de sincronización
del celo en la cobaya.
Sin embargo, las cobayas de T5 (78,9 ± 4,43 horas) que recibieron dosis
bajas de progesterona oral (0,11 mg/kg) necesitaron 34,3 horas más para
presentar el 50% de la apertura de la membrana vaginal desde el retiro de la
progesterona oral (p<0,05) si se compara con las cobayas de T1 (44,6 ± 4,16
horas) y T2 (52,0 ± 4,00 horas; Fig. 4). Las cobayas de los tratamientos 3
(60,0 ± 5,37 horas) y 4 (65,1 ± 4,42 horas) presentaron valores similares a los
observados en T5 (p>0,05; Fig. 4).
%202023.%20Efecto%20de%20diferentes%20dosis%20de%20la%20progesterona%20oral._archivos/image011.png)
Figura 4. Media y error estándar de horas trascurridas
desde el retiro de la progesterona (día 15) hasta la apertura de la membrana
vaginal en los diferentes tratamientos. T1= 0,33mg/kg. T2=0,28mg/kg. T3=0,22mg/kg.
T4=0,17mg/kg. T5=0,11mg/kg. ns=No hay diferencia entre tratamientos.
*=diferencia entre tratamientos. Prueba de Tukey al 5%.
Citología
vaginal
Se observó que más de 50% de células (Fig. 5; panel 1) presentes en la
citología de T1 fueron de tipo superficiales a las 37,7 ± 4,84 horas; sin
embargo, en T2 y T3 (52,0 ± 4,00 horas) y T4 (54,9 ± 4,43 horas) se necesitó en
promedio 14,3 horas más para tener el porcentaje de células superficiales
observado en T1 (Fig. 6).
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Figura 5.
Presencia de diferentes tipos de células desde la apertura de la
membrana vaginal (25%) hasta el cierre de la misma. Panel 1: Presencia de
células superficiales (celo). Panel 2: aparición de gran cantidad de
neutrófilos (ovulación). Panel 3: Células parabasales (metaestro).
%202023.%20Efecto%20de%20diferentes%20dosis%20de%20la%20progesterona%20oral._archivos/image015.png)
Figura 6.
Media y error estándar de horas trascurridas desde el retiro de la
progesterona (día 15) hasta la aparición del 50% o más de células superficiales
en los diferentes tratamientos. T1= 0,33mg/kg. T2=0,28mg/kg. T3=0,22mg/kg.
T4=0,17mg/kg. T5=0,11mg/kg. ns=No hay diferencia entre tratamientos.
*=diferencia entre tratamientos. Prueba de Tukey al 5%.
Los resultados combinados de la apertura de la
membrana vaginal y la presencia de células superficiales, confirmaron que el celo se presentó más rápido en las cobayas que recibieron dosis altas de
esta hormona.
Monta
La monta efectiva en T1 fue determinada a las 44,5 ± 6,25 horas y T2
(52,0 ± 4,00 horas), sin presentar diferencias significativas entre estos dos
tratamientos (p>0,05. Fig. 7). Las cobayas de T3 (68,0 ± 7,37 horas) y T4
(61,7 ± 4,84 horas) necesitaron en promedio 24 horas adicionales para ser
receptivas al macho. Los animales de T5 (78,8 ± 4,40 horas) fueron copuladas
34,3 horas después que las cobayas de T1 y 10,8 horas con relación a los
animales de T2 y T3 con diferencia entre estos (p<0,05). Estos resultados reafirman los conceptos que indican que la mayoría de las hembras reciben monta el mismo día que
presentaron apertura de la membrana vaginal y unas pocas necesitaron 2 horas
adicionales para la monta efectiva (Araníbar & Echevarría, 2014).
Por lo tanto, administrar entre 0,33 a 0,28 mg/kg permite que la cobaya
se ponga receptiva al macho aproximadamente a las 48 horas; sin embargo,
conforme se disminuye la dosis de progesterona el tiempo se alarga para que la
hembra sea receptiva al macho (Fig. 7).
%202023.%20Efecto%20de%20diferentes%20dosis%20de%20la%20progesterona%20oral._archivos/image017.png)
Figura 7.
Media y error estándar de horas trascurridas desde el retiro de la
progesterona (día 15) hasta la monta efectiva de las cobayas en los diferentes
tratamientos. T1= 0,33mg/kg. T2=0,28mg/kg. T3=0,22mg/kg. T4=0,17mg/kg.
T5=0,11mg/kg. ns=No hay diferencia entre tratamientos. *=diferencia entre
tratamientos. Prueba de Tukey al 5%.
Ovulación
El momento de la ovulación fue determinado por la presencia de más del
50% de neutrófilos en el frotis vaginal (Fig. 5; panel 2). Se determinó que
luego del retiro de la progesterona en T1 se produjo la ovulación a las 85,7 ±
4,84 horas valor similar al observado en los animales de T2 (88,0 ± 5,05
horas), sin diferencia entre estos grupos (p>0,05). Las cobayas de T3 (96,0
± 6,19 horas) y T4 (106,3 ± 7,13 horas) ovularon 20,6 horas luego de los
animales de T1 y T2.
Las cobayas que
necesitaron más tiempo
para ovular fueron las que recibieron dosis más bajas de progesterona (T5=113,1
± 4,42 horas; Fig. 8). La administración de dosis altas de P4 permitió reducir
en 34 horas aproximadamente la ovulación (T1 y T2), en comparación con los resultados descritos por Grégoire et
al. (2012), cuyos animales ovularon entre el día 4-5 (96-120 horas) pos retiro de la
administración de 0,22 mg/kg de Altrenogest por 15 días.
%202023.%20Efecto%20de%20diferentes%20dosis%20de%20la%20progesterona%20oral._archivos/image019.png)
Figura 8.
Media y error estándar de horas trascurridas desde el retiro de la
progesterona (día 15) hasta la ovulación en los diferentes tratamientos,
valorado por la aparición de neutrófilos en los frotis vaginales. T1=
0,33mg/kg. T2=0,28mg/kg. T3=0,22mg/kg. T4=0,17mg/kg. T5=0,11mg/kg. ns=No hay
diferencia entre tratamientos. *=diferencia entre tratamientos. Prueba de Tukey
al 5%.
En consecuencia, administrar 0,33 o 0,28 mg de progesterona oral, influye
en la presencia más temprana de la ovulación en las cobayas.
CONCLUSIONES
La administración de 0,33
mg de progesterona oral por kg de peso corporal en la cobaya, durante 15 días consecutivos sincroniza el
celo 48 horas post retiro de
la fuente de progesterona, provocando receptibilidad y ovulación de las hembras
en menor espacio de tiempo que al utilizar dosis bajas de esta hormona.
Al tratarse de un fármaco de
administración vía oral es de fácil uso y aplicación a nivel de campo o
laboratorio, permitiendo tener animales en determinado momento del ciclo estral,
factor esencial para la aplicación de biotécnicas reproductivas como la
inseminación artificial y la superovulación.
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Contribución de
los autores
Concepción
y diseño de la investigación: GSGP, PGVA, LEAG; análisis e interpretación de
los datos: GSGP, PGVA, LEAG; redacción del artículo: GSGP, PGVA, LEAG.
Conflicto de
intereses
Los
autores declaran que no existen conflicto de intereses.
%202023.%20Efecto%20de%20diferentes%20dosis%20de%20la%20progesterona%20oral._archivos/image002.jpg){kind=small}
, Pablo Geovanny Velesaca Ayala *%202023.%20Efecto%20de%20diferentes%20dosis%20de%20la%20progesterona%20oral._archivos/image003.jpg){kind=small}
, Luis Eduardo Ayala Guanga *