ABSTRACT
Background: The rational use of water and the application of
treatment systems for wastewater are presented as an alternative to remedy the
contamination of aquatic ecosystems. The activated IHPLUS® constitutes an alternative for the
bioremediation of contaminated water sources. The objective of the study was to
determine the toxicity by single exposure of the activated IHPLUS® product in
larvae of Artemia sp. Methods: Toxicity was evaluated by single exposure of the activated IHPLUS®
bioproduct in Artemia sp. larvae obtained from cysts included in artificial
seawater. The experimental groups of larvae were
exposed for 24 hours to five decreasing concentrations of the product under
study and were compared with a control group without exposure. The LC50 of the bioproduct was calculated as
well as the influence of factors that could be responsible for the
toxicity/mortality was studied, these were the presence or absence of micro-organisms
and pH. Results: The LC50 of the product was 0,042% in artificial seawater,
thus it is classified as non-toxic for crustaceans. It was shown that the activated IHPLUS® was toxic at
concentrations higher than 0,032% in Artemia
sp. larvae, under the test conditions. The pH turned out to be the responsible factor in the
production of the toxicity of the bioproduct in Artemia sp. Conclusion: The activated IHPLUS® was not dangerous for crustaceans in marine
environments.
Keywords: aquatic environment, crustaceans, toxic levels, pH, toxicity (Source: MESH)
INTRODUCCIÓN
El mal estado de los
ecosistemas tiene una repercusión directa en muchos animales y plantas que
viven en el agua y afecta a otras especies y a los seres humanos que necesitan
agua limpia (EEA, 2021). Para mitigar esta problemática se aplican diferentes
métodos, entre ellos la biorremediación, la que se ha convertido en una
interesante y promisoria alternativa a las convencionales técnicas para el
tratamiento de sustancias que contaminan el ambiente (Montenegro, 2019). El
IHPLUS®, registrado como marca en 2011 por la OCPI (Oficina Cubana
de Propiedad Industrial), inició la tecnología cubana basada en microorganismos
eficientes (ME). Dichas producciones se han instalado en diferentes plantas
de producción del bioproducto con múltiples usos, en
la sanidad animal y vegetal, como probiótico, en la nutrición de cultivos, la
eliminación de malos olores en instalaciones pecuarias y en la biorremediación
(Suárez, 2015).
En el
tratamiento de residuales líquidos, se destaca la eliminación de microalgas que
causaban constantes tupiciones en el sistema de riego y su aplicación en el
lago del parque Josone, Varadero, Matanzas; con el
proceso de biorremediación, mejoraron las concentraciones de los parámetros de
calidad del agua (Palma y Cruz, 2021). Para la investigación y desarrollo de
dicho producto resulta necesario estimar los posibles riesgos por exposición al
humano y especies representativas de los ecosistemas donde se prevé sea
aplicado.
En el caso de las
evaluaciones a pesticidas microbianos la Agencia de Protección Medioambiental
de los Estados Unidos ha emitido un grupo de guías de ensayos armonizadas
(US-EPA, OCSPP) para la investigación y desarrollo de pesticidas microbianos.
Dentro de estas metodologías están las guías de ensayos ecotoxicológicos
y una de ellas es la de evaluación de la toxicidad en invertebrados acuáticos
(EPA, 2015).
Actualmente, la Artemia sp., invertebrado que habita en cuerpos acuáticos
salinos, se utiliza para investigar la toxicidad de sustancias
químicas, físicas o biológicas, así como el efecto de residuos o mezclas
complejas. También se inserta como un ensayo de tamizaje en un programa de
evaluación de toxicidad, para estudios de modelos de acción tóxica de
sustancias, y estudios de la transferencia trófica de contaminantes (Persoone, 1987 y Artoxkit, 2003).
Constituye uno de los biomodelos más empleados para caracterizar el impacto de la
contaminación sobre ambientes acuáticos. Su característica de criptobiosis y euriplasticidad
lo hace un organismo particularmente
ventajoso con variadas aplicaciones. En las investigaciones
fundamentales y aplicadas de ecotoxicología el uso de esta especie permite
disponer de un biomodelo económicamente accesible,
con estabilidad biológica, y extrapolabilidad interlaboratorios (Persoone,
1987).
La
finalidad del estudio fue determinar la toxicidad por exposición única del
producto IHPLUS® activado en larvas de Artemia sp., organismo no cordado de ambientes acuáticos salinos, y
de esta forma contribuir con datos importantes sobre las perspectivas de la
utilización segura del mismo al interactuar con ecosistemas acuáticos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar donde se realizaron los estudios
El estudio se realizó en los
laboratorios de toxicología y ecotoxicología del Departamento de
Investigaciones Biológicas del Centro de Bioactivos Químicos, Universidad
Central “Marta Abreu” de Las Villas, Santa Clara, Villa Clara, Cuba. Estos se
realizaron entre el 12 de marzo del 2019 y el 9 de abril del mismo año.
Producto en estudio
Se evaluó una muestra de
IHPLUS® activado, suministrada por la Estación Experimental de Pastos y
Forrajes “Indio Hatuey”.
Esta consistió en el resultante de la fermentación líquida anaerobia de
microorganismos nativos provenientes de una fermentación sólida que contenía
bacterias aerobias y anaerobias, levaduras, hongos y lactobacilos, de origen
natural, no manipulados genéticamente, utilizado como inóculo para la
producción del fermentado líquido.
Además, se evaluó el biopreparado inactivado, el que se obtuvo mediante
esterilización durante una hora (h) en autoclave Hirayama
a 121oC y 1,216 x 106 Pa de presión. Todas
las muestras fueron utilizadas recién preparadas y el ensayo se realizó a
temperatura del laboratorio, de 22oC a 25oC.
Medio de cultivo
Se utilizó como medio de mantención
de las larvas de Artemia
sp. agua de mar artificial (AMA), la cual se preparó
a partir de una mezcla de sales según la fórmula de (Dietrich y Kalle, 1957)
Estudio de toxicidad aguda
Se realizó un ensayo de toxicidad
aguda en Artemia
sp. mediante las metodologías de Artoxkit
(2003), la guía ICT (2002) y el protocolo propuesto por (Banti
y Hadjikakou, 2021). Se procedió a la obtención de
larvas de Artemia sp. a partir
de quistes desecados obtenidos de Argent Chemical Laboratories,
Washington, USA, los que garantizaron óptimas condiciones de eclosión y
poblaciones homogéneas de nauplios. La prueba se basó
en la determinación de los efectos tóxicos producidos en larvas del crustáceo Artemia sp. tras una
exposición al bioproducto IHPLUS® activado.
Durante este ensayo se expusieron, en tanteos iniciales, los nauplios de Artemia sp. a concentraciones del producto en
estudio obtenidas por diluciones seriadas con factores de dilución 1:2 y 1:10.
Posteriormente se realizó el ensayo con cinco diluciones, formadas mediante un
factor de dilución, el cual permitió establecer 3 diluciones entre la mínima
dilución que produjo el 100% de mortalidad y la máxima dilución que no produjo
mortalidad. Dicho procedimiento permitió estimar la Concentración Letal Media
(CL50). En cada ensayo se incluyó un grupo control no expuesto, con
la misma cantidad de larvas en AMA.
Las larvas se observaron mediante lupa o microscopio estereoscópico y se
registró la mortalidad por grupos. Se consideró muerto el individuo incapaz de
moverse por diez segundos. Se realizó el cálculo del porcentaje de mortalidad a
partir del total de individuos expuestos.
Se evaluó la mortalidad a las 24 horas de exposición.
En otro estudio se formaron grupos con la misma cantidad de larvas y
réplicas para evaluar los posibles factores o parámetros que pudieran
determinar o influenciar en la mortalidad de los organismos de ensayo. Para
ello se evaluó una concentración específica de IHPLUS del 6%, bajo tres
condiciones diferentes, ver tabla 1.
Tabla 1. Ensayos de toxicidad del IHPlus activado
bajo diferentes condiciones.
|
Grupo
|
Concentración
|
Condición alterada
|
Influencia en la toxicidad
|
|
IHPLUS®
|
6%
|
-
|
Toxicidad real
|
|
IHPLUS® inactivado
|
Inactivación
|
Ausencia de microorganismos viables
|
|
IHPLUS® ajustado
|
pH ajustado a 7
|
pH
|
|
Control
|
-
|
-
|
-
|
El pH en la
tercera variante fue ajustado a siete mediante adición de carbonato de sodio,
Merck; medio por el cual se ajusta dicho parámetro químico en la preparación de
AMA.
A cada
grupo de todos los ensayos se le asignó al azar 40 larvas, distribuidas en
cuatro réplicas de 10 individuos cada uno. Cada
réplica de grupo permaneció en su respectivo pozo de placas de 24 pozos de
polipropileno estériles. Dichas placas se identificaron en la tapa con marcador
permanente mediante un código que permitiera realizar las lecturas a ciegas por
el personal indicado.
El
estudio se consideró válido si en el grupo control no ocurrió mortalidad de las
larvas igual o mayor del 10%.
Cálculos
y
análisis
Se calculó el porcentaje de letalidad para cada grupo mediante. Con los
datos obtenidos a diferentes concentraciones se confeccionó la curva
dosis-respuesta y se calculó la Concentración Letal
Media (CL50) mediante
ajuste no lineal a una curva Sigmoide utilizando el paquete estadístico Statística,
v10.
Según los
resultados obtenidos el bioproducto se clasificó
mediante la metodología propuesta por el Sistema Globalmente Armonizado de
Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (SGA) para peligros a corto
plazo (agudo) (Naciones Unidas, 2015) y que se muestra a continuación:
Tabla 2. Esquema de clasificación de las sustancias peligrosas para el
medio ambiente acuático (crustáceos).
|
Categorías de clasificación para crustáceos
|
|
Peligro a corto
plazo (agudo)
|
|
Categoría Aguda 1
|
C(E)L50
≤ 1,00 mg/L
|
|
Categoría Aguda 2
|
1,00 mg/L
< C(E)L50 ≤ 10,0
mg/L
|
|
Categoría Aguda 3
|
10,0 mg/L
< C(E)L50 ≤ 100
mg/L
|
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se consideraron válidas las pruebas
debido a que no se produjo mortalidad en los grupos controles a las 24 horas
post-exposición, ver Tabla 3.
Tabla 3. Mortalidad en los tanteos de
concentraciones del IHPLUS® activado en larvas de Artemia sp.
|
Grupos
|
Dilución
|
Concentración (porcentaje)
|
Mortalidad (porcentaje)
|
|
Primer tanteo (dilución 1:2)
|
|
1
|
1:2
|
50
|
100
|
|
2
|
1:4
|
25
|
100
|
|
3
|
1:8
|
12,5
|
100
|
|
4
|
1:16
|
6,25
|
100
|
|
5
|
1:32
|
3,125
|
100
|
|
1-I
|
1:2
|
50
|
100
|
|
2-I
|
1:4
|
25
|
100
|
|
3-I
|
1:8
|
12,5
|
100
|
|
4-I
|
1:16
|
6,25
|
100
|
|
5-I
|
1:32
|
3,125
|
100
|
|
Control
|
-
|
-
|
0
|
|
Segundo tanteo (dilución 1:10)
|
|
6
|
1:10
|
0,1
|
100
|
|
7
|
1:100
|
0,01
|
100
|
|
8
|
1:1000
|
0,001
|
0
|
|
9
|
1:10000
|
0,0001
|
0
|
|
10
|
1: 100000
|
0,00001
|
0
|
|
6-I
|
1:10
|
0,1
|
100
|
|
7-I
|
1:100
|
0,01
|
100
|
|
8-I
|
1:1000
|
0,001
|
0
|
|
9-I
|
1:10000
|
0,0001
|
0
|
|
10-I
|
1: 100000
|
0,00001
|
0
|
|
Control
|
-
|
-
|
0
|
I: bioproducto inactivado
En estos primeros estudios se apreció
que el producto IHPLUS® activado
e inactivado induce mortalidad en el 100% de los nauplios de Artemia sp. hasta la
dilución 1:100 (0,1%) en AMA. A concentraciones del 0,01% y superiores no
ocurrió muerte en las larvas, comportamiento similar a cuando se evaluó el
producto inactivado.
Los resultados del ensayo principal
donde se evaluaron cinco concentraciones entre un 0,1% y 0,01% del producto
aparecen en la tabla 4. Los resultados de mortalidad en función de la
concentración del IHPLUS® activado arrojaron que la CL50 se
estimó en un 0,042%, equivalente a 420 mg/L, en un medio salino como el
AMA.
Tabla 4. Resultados del estudio de toxicidad aguda del IHPLUS® activado en Artemia
sp.
|
Grupos
|
Factor de dilución
|
Concentración
(porcentaje)
|
Mortalidad (porcentaje)
|
CL50
|
|
|
1
|
1,78
|
0,01
|
100
|
0,042 %
(420 mg/L)
|
|
|
2
|
0,056
|
100
|
|
|
3
|
0,032
|
0
|
|
|
4
|
0,018
|
0
|
|
|
5
|
0,001
|
0
|
|
|
Control
|
-
|
-
|
0
|
|
|
Model
is: M=100*C**n/(Cl50**N+C**N) (Spreadsheet1)
Dep. Var. : MLevel of confidence: 95.0% (
alpha=0.050)
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Estimate
|
Standard
|
t-value
|
p-level
|
Lo. Conf
|
Up. Conf
|
|
|
n
|
30,94473
|
3093,743
|
0,010002
|
0,992647
|
-9814,73
|
9876,616
|
|
|
Cl50
|
0,04231
|
1,338
|
0,031622
|
0,976760
|
-4,22
|
4,300
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Respecto a la toxicidad del producto
con variaciones en las condiciones de la mezcla para elucidar el factor
responsable de la misma se obtuvieron los resultados que se muestran en la
tabla 5.
Tabla 5. Resultados de toxicidad del IHPLUS® activado en Artemia
sp. bajo
diferentes condiciones.
|
Grupo
|
Concentración
|
Condición alterada
|
Mortalidad (porcentaje)
|
|
IHPLUS®
|
6%
|
-
|
100
|
|
IHPLUS® inactivado
|
Inactivación
|
100
|
|
IHPLUS® ajustado
|
pH ajustado a 7
|
0
|
|
Control
|
-
|
-
|
0
|
De los resultados
anteriores se infirió que el principal factor que debe producir la toxicidad
del producto debe ser el pH. El pH del IHPLUS® activado resulta muy bajo para permitir la viabilidad de las larvas del crustáceo
en el medio de ensayo. Al determinar el pH en las diferentes variantes, resultó
que el producto inalterado tuvo 3,2 y el producto al 6% tuvo 3,9. Cuando se
inactivó la fracción biótica del producto la mortalidad persistió, pero cuando
se ajustó el pH del producto a nivel neutro, pH más cercano al medio AMA, no
ocurrió mortalidad en las larvas.
Teniendo en consideración
los resultados obtenidos en el experimento y de acuerdo con el sistema de
clasificación para peligros a corto plazo (agudo) para el medio ambiente
acuático (Naciones Unidas, 2015), el producto IHPLUS® no puede ser clasificado dentro de las categorías de toxicidad aguda
debido a que el valor de la CL50 resultó muy superior a los niveles
de categorías de peligro a corto plazo, los que clasifican a la sustancias
hasta 100 mg/L y en el producto en estudio dicha determinación resultó 420
mg/L. Los resultados clasifican al producto como no peligroso en exposición
aguda para organismos acuáticos, aunque se deben considerar los resultados con
otros organismos para establecer una clasificación de peligro para el medio
ambiente acuático.
En la bibliografía no se
encuentran reportes sobre la toxicidad de productos de origen similar al
evaluado en Artemia
sp. Sin embargo, el uso de ME frente al
tratamiento de diversas fuentes de vertimiento de aguas al medio ambiente,
donde habitan organismos cercanos filogenéticamente a Artemia sp., ha sido ampliamente estudiado. Como
se aprecia en la tabla 6 varios autores recomiendan utilizar este tipo de
producto en diluciones entre 1:1000 y 1:10000, dichas concentraciones al ser
evaluadas en nuestros estudios (Tabla 2), no produjeron mortalidad en Artemia sp.
Tabla 6.
Reportes del uso de ME en el tratamiento de aguas.
|
Concentraciones empleadas
|
Usos
|
Autores
|
|
1L ME/1000 L
Agua (1:1000)
|
Tratamientos de aguas residuales por biorremediación
|
Mendietta L. (2015)
|
|
Dosis de
activación: 1L ME/m3Agua (1:1000)
Dosis de
mantenimiento: 1L ME/10 000 L Agua (1:10 000)
|
Tratamiento de lagunas
|
OISCA (2009)
|
|
Dosis de
activación: 1L ME/m3Agua (1:1000)
Dosis de
mantenimiento:1L ME/10 000 L Agua (1:10 000)
|
Efluentes de la industria de la destilería
|
Karthick.
S (2014)
|
|
1 mL ME / 1000 mL agua residual (1:1000)
|
Agua Residuales de Granja Porcina
|
Toc R.M. (2012)
|
Nota. ME: microorganismos eficientes
CONCLUSIONES
El bioproducto IHPLUS® activado resulta tóxico a
concentraciones superiores a 320 mg/L en larvas de Artemia sp., bajo las condiciones
del ensayo.
El producto
de origen microbiano IHPLUS® activado resulta no peligroso debido a
que la CL50 fue de 420 mg/L en Artemia sp.
La acidez
del pH resulta el principal factor responsable de la toxicidad del producto
IHPLUS® activado en el biomodelo Artemia sp.
REFERENCIAS
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Contribución de los
autores
Concepción y diseño de la investigación:
MSW, OMC, EAJ, ZACH, MDS, LLP; análisis e interpretación de los datos: MSW,
OMC, EAJ, ZACH, MDS, LLP; redacción del artículo: MSW, OMC, EAJ, ZACH, MDS, LLP.
Conflicto de
intereses
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.
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, Osmany Marrero Chang *